Transfer RNA

1 Introduktion

tRNA:s veckning och stabilitet är avgörande för effektiv översättning, och defekter i endera egenskapen kan leda till minskade mängder tRNA, vilket resulterar i tillväxtdefekter i jäst och sjukdom hos människor (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). I jästen Saccharomyces cerevisiae finns det två stora cellulära kvalitetskontrollvägar som är kända för att bryta ned defekta tRNA-arter. Den första vägen är den nukleära övervakningsvägen, som verkar på pre-tRNA i kärnan med hjälp av kärnexosomen och TRAMP-komplexet (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al, 2005) genom att degradera pre-tRNAiMet som saknar m1A58-modifieringen eller som har en felbearbetad 3′-släpp (Ozanick et al., 2009) och en fraktion av pre-tRNA av vildtyp (WT) (Gudipati et al., 2012). Den andra vägen är den snabba RTD-vägen (rapid tRNA decay), som bryter ner specifika mogna, hypomodifierade eller destabiliserade tRNA-arter genom aktiviteten hos 5′-3′-exonukleaserna Rat1 och Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD framkallas i mutanter som saknar någon av flera modifieringar i tRNA-kroppen eller genom destabiliserande mutationer, och för alla identifierade RTD-substrat återställer MET22-deletion helt och hållet tRNA-nivåer och tillväxt (Alexandrov et al, 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Undertryckande av RTD i met22Δ-stammar antas bero på hämning av exonukleaserna Rat1 och Xrn1 av metaboliten 3′-phosphoadenosin-5′-fosfat, som har ökade nivåer när Met22 hämmas (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).

I det andra tillvägagångssättet användes northern blots för att undersöka både hastigheten och specificiteten hos tRNA-nedbrytningen för RTD-substrat i temperaturkänsliga modifieringsmutanter. I detta tillvägagångssätt analyserades RNA isolerat från celler vid olika tidpunkter efter temperaturförändring för nivåer av specifika tRNAs. Från denna analys fann vi att 50 % av tRNAVal(AAC) bröts ner i en trm8Δ trm4Δ-mutant inom 30 minuter efter en förskjutning från 28 till 37 °C, medan de på samma sätt hypomodifierade tRNAiMet, tRNAMet och tRNAPhe inte uppvisade någon minskning (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). Vidare kunde de relativa nivåerna av laddat och oladdat tRNA mätas genom att utföra northern blot under sura förhållanden, vilket visade att nivåerna av laddat tRNAVal(AAC) reducerades med 50 % inom 25 minuter efter temperaturförskjutning i en trm8Δ trm4Δ-mutant och att nivåerna av oladdat tRNAVal(AAC) verkade opåverkade (Alexandrov et al, 2006).

Det tredje tillvägagångssättet var genom tRNA-suppression med hög kopia, där en plasmid med hög kopia som uttrycker ett visst tRNA introducerades i en temperaturkänslig tRNA-modifieringsmutant. Om tRNA var ett RTD-substrat och temperaturkänsligheten var ett resultat av att en enda tRNA-art bröts ned, skulle överuttryck av tRNA:t undertrycka defekten. Således fann vi att temperaturkänsligheten hos en trm8Δ trm4Δ-mutant undertrycktes av en högkopierad plasmid som uttryckte tRNAVal(AAC), vilket tyder på att temperaturkänsligheten främst berodde på förlusten av tRNAVal(AAC) och att de saknade modifieringarna var viktiga för tRNA-stabiliteten (Alexandrov et al., 2006). På liknande sätt har RTD-substraten hos flera andra tRNA-modifieringsmutanter också identifierats med hjälp av denna metod, inklusive tRNASer(CGA) och tRNASer(UGA) i tan1Δ trm44Δ-mutanter (som saknar ac4C12 och Um44) och i trm1Δ trm4Δ-mutanter (som saknar m2,2G26 och m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al, 2012; Kotelawala et al., 2008).

För det fjärde använde vi en genetisk ersättningsmetod för att identifiera RTD-determinanter i tRNASer-familjen genom att ersätta den enda essentiella tRNASer(CGA)-genen (SUP61) med olika tRNASer(CGA)-varianter i WT-stammen och met22Δ-stammen, och sedan analysera tillväxt vid olika temperaturer. Med hjälp av detta tillvägagångssätt fastställde vi att den kombinerade acceptor- och T-stammens stabilitet var starka bestämningsfaktorer för RTD-känslighet i tRNASer(CGA)-genfamiljen (Whipple et al., 2011). Denna slutsats stöddes ytterligare av en femte metod för att mäta RTD, där vi in vitro visade att tRNASer(CGA)-varianter som saknar ac4C12 och Um44, eller som har destabiliserande mutationer i acceptatorstammen, var mer mottagliga för nedbrytning av Xrn1 och mer mottagliga för avlägsnande av 5′-fosfat med hjälp av kalvintestinal fosfatas (Whipple et al, 2011).

I denna översikt kommer vi att diskutera våra nyligen utvecklade sjätte och sjunde tillvägagångssätt för att studera RTD-substrat, som har visat sig vara extremt värdefulla för att bredda vår förståelse av RTD-vägen. I den sjätte metoden används en fluorescerande reporter för att omfattande analysera bibliotek med tusentals tRNA-varianter i WT- och met22Δ-stammar. Genom denna metod har vi identifierat 643 troliga RTD-substratkandidater, många i regioner som inte förväntas framkalla RTD baserat på tidigare arbete (Guy et al., 2014). Vi kommer att visa data som visar att detta tillvägagångssätt kan användas för att studera tRNA-funktionen under olika förhållanden och kommer att diskutera andra tillämpningar av tillvägagångssättet.

Det sjunde tillvägagångssättet använder sig av poisonprimerförlängning för att mäta tRNA-nivåerna i en WT- och met22Δ-stam och är värdefullt genom sin förmåga att specifikt mäta en variant av tRNA även i närvaro av WT-tRNA vars sekvens kan skilja sig med endast en enda rest. Vi tillhandahåller en detaljerad metodik för detta tillvägagångssätt och diskuterar några av dess andra möjliga tillämpningar.