Aunque la obtención de imágenes de células vivas es deseable, no siempre es factible y en muchas situaciones las células se fijan con el fin de proporcionar una «instantánea» de la naturaleza y la distribución de las moléculas dentro de una célula al tiempo que se minimizan los cambios derivados del movimiento celular, la degradación de la muestra, etc. Existe una amplia gama de métodos de fijación que actúan a través de diferentes mecanismos y sobre diferentes componentes celulares. Cada método tiene ventajas y desventajas y la elección del método de fijación para un experimento concreto debe tener en cuenta estos factores. Aquí utilizamos imágenes espectroscópicas Raman de células vivas, y las comparamos con células conservadas con aldehído, o métodos de fijación basados en disolventes orgánicos para evaluar los cambios químicos inducidos por cada fijador, y su impacto en la calidad de las imágenes que se pueden obtener de las células fijadas. En general, los métodos de fijación con aldehídos se comportaron significativamente mejor que los disolventes orgánicos, con una pérdida menos grave de información bioquímica. Los fijadores basados en aldehídos muestran una alteración del contenido bioquímico de las células, atribuida a la formación de aductos, pero esto puede minimizarse optimizando la temperatura de fijación o eliminando la formación de aductos mediante tratamientos de permeabilización basados en detergentes como segundo paso (a costa de la pérdida de otra información bioquímica). Los resultados mostraron que los disolventes orgánicos, por otro lado, conducen a una grave pérdida de contenido celular, atribuida a la pérdida de la integridad de la membrana tras la eliminación de los lípidos. Además, la fijación con aldehídos antes de la permeabilización con disolventes orgánicos no proporciona una protección adecuada del contenido citoplasmático. El uso de imágenes Raman es ideal para comparar grupos de células en términos de su contenido molecular, y los resultados muestran que los métodos de fijación con aldehídos son preferibles para estudios en los que el contenido molecular global de las muestras es importante. Aunque no existe un método de fijación universal para todas las aplicaciones, los resultados obtenidos aquí nos permiten ofrecer algunos principios generales: cuando la similitud espectral con las células vivas es importante, es preferible la fijación con paraformaldehído a temperatura ambiente, a costa de algunas hemorragias y la formación de vacuolas. Cuando la preservación de la estructura celular o la distribución biomolecular es importante, una mezcla de paraformaldehído y glutaraldehído sería más apropiada, pero a costa de algunos cambios en el perfil espectral, particularmente en las bandas relacionadas con el ADN.