Bakteriální kultivace s translátorem buněčné signalizace a moduly regulátoru růstu pro autonomně regulované složení kultury

Řízení rychlosti růstu buněk signálemAI-1

Nejprve jsme testovali řízení rychlosti růstu buněk E. coli prostřednictvím transkripční regulace genu ptsH, který se podílí na transportu cukru. HPr (kódovaný ptsH) je všeobecně známý jako jeden z řady proteinů (např. E1, HPr, EII), které postupně přenášejí fosforylovou skupinu z fosfoenolpyruvátu (PEP) na glukózu (nebo jiný sacharid PTS)34 . HPr je vysoce konzervovaný37. Nedávno jsme zjistili, že HPr interaguje s kinázou AI-2 LsrK, čímž ovlivňuje příjem AI-235. Funkci modulující AI-2 jsme později využili při konstrukci buňky vnímající AI-2. Zde jsme prokázali, že mutantní kmeny ptsH rostou v minimálním médiu obsahujícím glukózu pomaleji než kmeny divokého typu (doplňkový obr. 1a). Když byl ptsH umístěn pod promotor indukovatelný IPTG u mutanta ptsH, bylo možné řídit rychlost růstu na základě přídavku IPTG (doplňkový obr. 1b). Důležité je, že jsme prokázali, že indukce exprese ptsH vede ke zvýšení rychlosti růstu buněk. Stejně důležité je, že toto chování je nezávislé na tom, zda médium obsahuje glukózu jako hlavní zdroj uhlíku (Doplňkový obr. 1c).

Na základě tohoto důkazu konceptu jsme dále vytvořili rychlost růstu řízenou signálem QS. Pro konstrukci řídicího kmene byl ptsH umístěn pod kontrolu promotoru AI-1 lasI QS na plazmidu pAHL-HPr (obr. 2a) v mutantním kmeni ptsH PH04. Na jiném místě plazmidu byly pod konstitutivním promotorem T5 exprimovány dsRedExpress2 pro vizualizaci buněk a LasR, který je nutný pro aktivaci promotoru lasI. Přídavek AI-1 ke kontrolnímu kmeni zvýšil rychlost růstu buněk až na 1,8násobek základní rychlosti růstu v závislosti na dávce (obr. 2b). Naměřená specifická rychlost růstu (mezi 1 a 4 h po přidání AI-1) posloužila jako základ pro model rychlosti růstu Monodova typu založený na hladině AI-1 (obr. 2c).

AI-1 moduluje složení v kokulturách kontrolních buněk

Kolekultury kontrolních buněk regulované AI-1 byly poté kultivovány s jinými kmeny, aby se ověřilo, že přidání AI-1 změnilo složení kokultury. Růstové buňky regulátorů exprimující červený fluorescenční protein (PH04 pAHL-ptsH) byly kokultivovány buď s kmenem PH04 pCT6, nebo TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 má podobnou základní rychlost růstu jako PH04 pAHL-ptsH, zatímco TOP10 pT5G roste výrazně rychleji. Kultury byly inokulovány při přibližně stejné hustotě buněk a doplněny různými hladinami AI-1. Po 8 h byly odebrány vzorky pro analýzu pomocí fluorescenční mikroskopie a kvantifikovány pomocí ImageJ. Podle očekávání se při kultivaci kontrolních buněk s PH04 zvyšovalo složení kultury kontrolních buněk se zvyšující se koncentrací AI-1 (obr. 3a). Podobný trend byl pozorován i při kultivaci buněk s TOP10, a to navzdory rychlejšímu růstu TOP10 (obr. 3b). To znamená, že ve společných kulturách bez AI-1 podíl kontrolních buněk ve společných kulturách s TOP10 skutečně výrazně poklesl z počátečních ~0,5 na ~0,09 během následujících 8 h. Přídavek AI-1 tento rozdíl v rychlosti růstu vyvrátil a vedl k vyššímu množství kontrolních buněk během stejného období 8 h. Tyto výsledky ukazují, že bez ohledu na ostatní kmeny v kultuře a jejich příslušné rychlosti růstu moduluje AI-1 (který není signální molekulou QS E. coli) rychlost růstu upraveného kontrolního kmene a změna proběhla dostatečně rychle, aby umožnila pozorovatelnou změnu ve složení kultury – a to i v relativně krátkodobých dávkových podmínkách (na rozdíl od krmných dávek, opakovaných dávek nebo kontinuálních kultur).

Následující kmen regulátoru regulovaného AI-1 byl ko-kultivován s buňkami, které při indukci produkují AI-1 . Kmeny PH04 pSox-LasI a PH04 pAHL-HPr byly kultivovány společně. Plazmid pSox-LasI obsahuje lasI, který syntetizuje AI-1, pod pyocyaninem indukovatelným promotorem soxS7. V tomto experimentu dostává řídicí kmen signál od translačního kmene, který naopak produkuje AI-1 v reakci na pyocyanin. Tímto způsobem se ukázalo, že schéma řízení společné kultivace reaguje na konkrétní molekulární signál. Zde byla každá kultura naočkována s přibližně stejnou počáteční hustotou a ko-kultury byly buď vystaveny pyocyaninu, nebo ne. Vystavené kultury vykazovaly zvýšenou produkci AI-1 a odpovídající zvýšené složení PH04 pAHL-HPr během 5 h (obr. 3c). Tyto výsledky ukazují, že AI-1 produkovaný z alternativního kmene může modulovat rychlost růstu řídicího kmene a že k tomu může docházet v časovém měřítku potřebném k ovlivnění změny v dávkovém procesu. Kromě toho to ukazuje potenciální proveditelnost uživatelem regulované kokultury založené na uživatelsky specifické aplikaci molekuly nebo induktoru, v tomto případě pyocyaninu. Dále jsme zkonstruovali translační kmen, abychom vytvořili autonomně regulovanou kokulturu založenou na všudypřítomné signální molekule AI-2.

Konstrukce translačních buněk vnímajících AI-2

Pro konstrukci buněčných linií, které vnímají AI-2 a produkují AI-1, jsme zkonstruovali kmeny tak, aby aktivovaly expresi LasI, který syntetizuje AI-1, když je aktivován promotor AI-2 lsr. Použili jsme systém dvou plazmidů pro zesílení exprese ze slabého promotoru lsr25 (obr. 4a). Stručně řečeno, AI-2 je fosforylován LsrK a fosforylovaný AI-2 uvolňuje represi promotoru LsrR, čímž se zvyšuje transkripce genů lsr transportéru a urychluje se příjem AI-2 . Současně aktivace promotoru lsr zprostředkovaná AI-2 vede k transkripci polymerázy T7 RNA z plazmidu pCT6 a následné transkripci lasI z plazmidu pET-LasI.

Systém byl nejprve zkonstruován v hostitelském kmeni E. coli CT104, který je mutantem luxS (např. neschopným produkovat AI-2). CT104 také postrádá lsrFG, který je zodpovědný za degradaci fosforylovaného signálu AI-2, čímž se zvyšuje citlivost buňky na AI-238. Ověřili jsme, že tato buněčná linie CT104 pCT6 pET-LasI produkuje AI-1 při kultivaci v kondicionovaném médiu (CM) z BL21 produkující AI-2 (doplňkový obr. 2). BL21 byla kultivována na různou hustotu buněk, CM byla odebrána a buňky CT104 byly kultivovány v odebrané CM. Důležité je, že AI-1 produkovaný buňkami CT104 koreloval s hustotou buněk BL21 produkujících AI-2 (doplňkový obr. 2a). Testovali jsme také, zda translační buňky přidané do konsorcií s různými podíly buněk produkujících AI-2 mohou produkovat signál AI-1 v závislosti na složení konsorcia. Buňky CT104 byly přidány ke kulturám s různým poměrem BL21 (luxS+) a BL21 ΔluxS. Po 6 hodinách byla úroveň signálu AI-1 v extracelulárním médiu indikátorem složení kultury, které je zase založeno především na počáteční frakci luxS+ buněk25 (doplňkový obr. 2b).

Výše uvedené experimenty ukázaly, že lze zkonstruovat buněčnou linii, která produkuje AI-1 v reakci na AI-2 z buněk produkujících AI-2. Na základě těchto experimentů bylo možné zkonstruovat buněčnou linii, která bude produkovat AI-1 v reakci na AI-2. Tyto experimenty byly provedeny v LB médiu, nikoli v médiu s glukózou. Přítomnost glukózy inhibuje vychytávání AI-2 a aktivitu promotoru lsr39 a použití buněk CT104 by mohlo být potenciálně omezeno na média bez glukózy (viz doplňkový obr. 3 pro schéma dráhy AI-2 QS). Na základě znalostí systému AI-2 QS jsme se pokusili vytvořit kmen, který by byl schopen vychytávat AI-2 a aktivovat promotor lsr v médiích obsahujících glukózu. Tímto způsobem by naše výsledky mohly být použity obecněji. Již dříve jsme prokázali, že HPr (kódovaný ptsH) interaguje s LsrK, čímž inhibuje kinázovou aktivitu LsrK, a bylo prokázáno, že mutanti ptsH vychytávají AI-2 i v médiích obsahujících glukózu35. Proto jsme předpokládali, že použití kmene PH04 (ΔptsH ΔluxS) jako hostitelského kmene by umožnilo produkci AI-1 na bázi AI-2 v médiích obsahujících glukózu. Testovali jsme translační buňky s použitím obou hostitelských kmenů v médiích LB a M9 s glukózou a bez AI-2. Hladina produkovaného AI-1 byla závislá na přídavku AI-2, ale také na hostitelském kmeni a médiu (obr. 4b). Oba kmeny produkovaly AI-1, když byly buňky přidány do LB média s AI-2. Podle očekávání vedlo v médiu M9 použití hostitelského kmene CT104 k malé nebo nevýznamné násobné změně aktivity AI-1 při porovnání kultur s AI-2 a bez něj. Důležité je, že translační buňky PH04 však vykazovaly AI-2 aktivovanou produkci AI-1 v médiu M9 + glukóza. In this way, the engineered system could be used in glucose-containing media.

Characterization of PH04 translator cells

Překladové buňky PH04 přijímají signální molekulu AI-2, přenášejí signál aktivací exprese LasI a syntetizují a vylučují AI-1. Požadovaný výstup AI-1 je pak funkcí vstupu AI-2. Charakterizovali jsme produkci AI-1 signalizovanou AI-2 v translačním kmeni PH04 v průběhu času a pro řadu biologicky relevantních koncentrací AI-2. Bylo zjištěno, že míra produkce AI-1 translačními buňkami kmene PH04 je závislá na dávce AI-2 (obr. 5a). Poznamenáváme, že za těchto a podobných podmínek je AI-2 většinou spotřebován během 4 h (obr. 5b). Přidání AI-2 nebo produkce AI-1 na bázi AI-2 v těchto dávkových kulturách nevedlo k pozorovatelnému snížení růstu buněk (obr. 5c). Poté jsme charakterizovali rychlost produkce AI-1 na buňku v čase pro každou testovanou koncentraci AI-2 vynesením logistické funkce přes údaje o AI-1, určením derivace této rovnice v čase a vydělením derivace hustotou buněk v čase (doplňková tabulka 1), čímž jsme získali specifickou rychlost produkce závislou na čase. Výsledné grafy (obr. 5d) ukazují odhadovanou míru produkce AI-1 na buňku jako funkci přidaného AI-2 a času od přidání AI-2. Jak bude ukázáno později, je to v souladu se základním pozorováním, které jsme pozorovali, že trajektorie genové exprese v reakci na počáteční narážku je poměrně robustní21,38,40.

Dále byl testován vliv AI-1 produkovaného translačními buňkami PH04 na rychlost růstu kontrolních buněk reagujících na AI-1. To znamená, že růstově citlivé buňky byly přidány do CM obsahující AI-1 z translátorových buněk, které byly vystaveny různým hladinám AI-2, a kultivovány po dobu ~3 h (doplňkový obr. 4a). Kromě toho, co bylo ukázáno na obr. 5, kde je AI-1 generován z přímé expozice AI-2, tento experiment ukazuje, že buněčný překlad AI-2 na AI-1 lze provést s potřebnou expresí a dynamikou buněčné kultivace tak, aby byla ovlivněna rychlost růstu druhé populace (doplňkový obr. 4b). Poznamenáváme také, že se ukázalo, že dynamická rychlost růstu kontrolních buněk v čase klesá v průběhu následujících 3 h. Toto pozorování bylo dramatičtější při pozdějších pokusech se společnou kulturou.

Autonomní regulace složení společné kultury

Poté jsme přidali translační buňky (označované jako populace A) a kontrolní buňky reagující na AI-1 (populace B) do roztoků s různými počátečními koncentracemi AI-2 . Ve společných kulturách translačních a kontrolních buněk translační buňky autonomně regulují složení konsorcia na základě počáteční hladiny AI-2. Na doplňkovém obr. 5 je vidět, že ko-kultury se zvýšenou počáteční hladinou AI-2 vedly ke zvýšení AI-1 (doplňkový obr. 5b) a odpovídajícímu zvýšení relativní početnosti populace B (doplňkový obr. 5a). Tyto výsledky prokázaly koncept signálem zprostředkované autonomní kontroly populací konsorcií. Důležité je, že odhady rychlosti růstu pro populaci A a populaci B se shodovaly s očekávanými hodnotami rychlosti růstu naměřenými během monokultivačních experimentů (doplňkový obr. 5c).

Poté, co jsme prokázali, že translační buňky mohou regulovat složení konsorcií na základě expozice AI-2, jsme vytvořili matematický model k charakterizaci dynamiky systému. Tímto způsobem lze předvídat chování kokultury za určitých počátečních podmínek, návrhů rychlosti růstu atd. s cílem určit parametry potřebné k dosažení požadovaného výstupu. Tento koncepčně jednoduchý matematický model byl vytvořen za účelem předpovědi chování kokultury na základě údajů z jednotlivých kmenů. Model se skládá ze čtyř obyčejných diferenciálních rovnic, jedné pro každou populační hustotu, koncentraci substrátu a koncentraci AI-1 (doplňkové tabulky 2 a 3). Pro modelování růstu buněk a koncentrace substrátu byla použita Monodova růstová kinetika s konstantním koeficientem výtěžnosti, přičemž další funkce zohledňovaly produkci a/nebo účinky molekul QS. AI-1 produkovaný populací A je založen jak na úrovni expozice AI-2, tak na čase (fAI1). V předchozí práci38 jsme zjistili, že časově závislé trajektorie chování buněk jsou důsledkem počáteční expozice autoinduktoru, takže časově závislé funkce produkce AI-1 by zde byly pravděpodobné. Rychlost růstu populace B byla formulována na základě převládající hladiny AI-1 (fHPr). Maximální specifické rychlosti růstu byly měřeny na základě experimentálních údajů, výtěžky byly odhadnuty na základě experimentálně zjištěné hustoty stacionární fáze a známých počátečních koncentrací substrátu a hodnoty K1 a K2 byly zvoleny na základě literárních hodnot pro glukózu. K řešení systému ODE byl použit řešič ode45 programu MATLAB (verze R2016a). Model lze použít k zobrazení toho, jak se podle těchto jednoduchých fenomenologických rovnic rychlosti a nejlépe odpovídajících konstant předpokládá, že se populace ko-kultury bude měnit v čase. Jak bylo uvedeno, poskytuje to základ pro určení, zda lze vůbec předpovídat vývoj ko-kultury v omezeném čase, který je k dispozici v dávkové kultuře. Důležité je, že naše výsledky z monokultur slouží k simulaci experimentálních výsledků z kokultur.

To znamená, že jsme dále hodnotili autonomně naprogramované řízení kokultur pomocí modelových předpovědí. Ko-kultury populací A a B byly umístěny společně pro řadu počátečních buněčných populací a poté byly přidány do médií s předepsanými hladinami AI-2, aby se uvedla do pohybu populační trajektorie. V našem systému je počáteční složení zvoleno na základě poměru buněk dodaných do společné kultury a poté je složení kultury v průběhu času autonomně upravováno na základě hladiny AI-2 v médiu. Výsledky jsme porovnali s naším modelem. Na obr. 6 je znázorněno složení kokultury a hladina AI-1 po 5 hodinách pro různé podmínky včetně různých počátečních poměrů A:B a hladiny AI-2. V těchto testech jsme použili jednu počáteční hustotu buněk populace. Důležité je, že jsme zjistili, že náš model dobře předpovídá experimentální výsledky jak hladiny AI-1, tak složení kokultury. Poznamenáváme také, že model lze použít k výběru počátečních podmínek, které poskytují požadovaný výstup. Například pro cílovou populaci B s relativní hustotou buněk 55 % v 5 h by mohla být kokultura zahájena s počátečním poměrem A:B 60:40 a koncentrací AI-2 40 µM. Byly testovány a ověřeny další scénáře, jak je znázorněno na obrázku. Tyto výsledky jasně ukazují, že jak počáteční stav složení buněk (např. poměr A:B), tak expozice různým hladinám AI-2 ovlivňují trajektorii populace ko-kultury. Neméně důležité však je, že ortogonální signální molekula AI-1 se chovala podle modelu. Předpokládáme, že rozšířením o tento a další translační signály bude možné navrhovat a/nebo řídit další, rozmanitější nebo složitější konsorcia.

To znamená, že jsme testovali systém regulátoru společné kultivace vystavením koncentraci AI-2, 80 µM, která byla vyšší než koncentrace AI-2 použitá k charakterizaci translačních buněk a pro kterou jsme neměli model. Výsledky ko-kultury (obr. 6) jsme použili k odhadu chování translačních buněk v monokultuře při této koncentraci AI-2. Poté jsme provedli pokusy v monokultuře přidáním 80 µM AI-2 k translačním buňkám a ukázali jsme, že jsme schopni předpovědět chování v monokultuře pomocí údajů z kokultury a modelu. Na doplňkovém obr. 6a je znázorněna rychlost produkce AI-1 předpovězená na základě údajů z kokultur a modelu (čára) a skutečná rychlost produkce AI-1 během monokulturního experimentu (datové body). Doplňkový obr. 6b ukazuje předpovězené hladiny AI-1 v monokultuře v průběhu času ve srovnání se skutečně naměřenými hladinami AI-1. Předpovězená hladina AI-1 byla určena pomocí modelu, do kterého byla zadána odhadovaná míra produkce AI-1 a počáteční hustota buněk monokultury.

Nakonec jsme testovali náš kokultivační systém po delší časové období pomocí opakovaného dávkového krmení s několikanásobným přídavkem AI-2 (obr. 7). Zde bylo naším cílem rozšířit populační trajektorii nad rámec trajektorie získané změnou počátečního složení a vystavení fixní hladině AI-2 v jednoduché dávkové kultuře. Tímto způsobem jsme testovali robustnost řídicího schématu. Například na obr. 6 jsme u kultur s počáteční koncentrací ~40 % populace B zjistili, že můžeme dosáhnout pouze úrovně populace B, která se blíží 60 %, a to pouze vystavením vysokým hladinám (>80 μM) AI-2. Při testování systému opakovaných dávek jsme se domnívali, že bychom mohli zvýšit populaci B na více než 80 % pouhým opětovným nasazením a prodloužením systému v čase. Přidali jsme naši ko-kulturu do média s různými hladinami AI-2 a každé 3 hodiny jsme buňky resuspendovali do čerstvého média s dalším AI-2. Bezprostředně před každou resuspenzí byly odebrány vzorky pro analýzu koncentrace AI-1 a složení buněčné kultury (obr. 7a, b). Byla také měřena hustota buněk a aktivita AI-2 (doplňkový obr. 7). Zjistili jsme, že v tomto složitějším experimentálním uspořádání systém obecně funguje podle návrhu. Zjistili jsme, že působením menšího množství AI-2 (20 a 40 μM) jsme mohli dosáhnout téměř 80% populace B. Během tohoto testu jsme však zjistili, že se naše experimentální výsledky rozcházejí s výsledky předpovězenými naším matematickým modelem. Podrobněji jsme se zabývali produkovaným AI-1 a rychlostí růstu kultur během každého 3hodinového úseku, abychom získali představu o dynamice kultury na základě pozorovaného rozporu s jednoduchým modelem. Například AI-1 produkovaný během druhého a třetího 3hodinového cyklu byl vyšší, než předpovídal model. Při zpětném pohledu to dávalo smysl, protože buňky po prvním dávkovém cyklu již produkovaly LasI (který syntetizuje AI-1) a další AI-2 pravděpodobně vyvolával další produkci LasI (nezařadili jsme značku degradace LasI, takže se mělo předpokládat jeho udržení). Poté jsme model upravili tak, aby míra produkce AI-1 na začátku každé následující resuspenze v novém médiu byla stejná jako na konci předchozího cyklu (obr. 7c, plné čáry). Začlenění těchto nových funkcí pro produkci AI-1 do modelu vedlo k hodnotám AI-1, které přesně odpovídaly experimentálním údajům o AI-1 (obr. 7a, model v plných čarách). Podobně jsme odhadli rychlost růstu buněk regulátoru (viz doplňková poznámka 1) a zjistili jsme, že rychlost růstu v kombinaci s koncentracemi AI-1 neodpovídá naší dřívější funkci fAI1 (obr. 7d). Poznamenáváme, že pro výpočet rychlosti růstu kontrolních buněk jsme předpokládali, že rychlost růstu translačních buněk zůstává konstantní, ačkoli se mohla v důsledku opakovaných přídavků AI-2 mírně snížit. Zatímco zpočátku se zdálo, že se rychlost růstu regulátorů v závislosti na AI-1 zvyšuje, s dalšími resuspenzemi v čerstvém médiu se celková rychlost růstu snížila. Již dříve jsme zaznamenali dynamický pokles rychlosti růstu při nadměrné expresi HPr a LasI (doplňkové obr. 4 a 5). Zde máme podezření, že příčinou sníženého růstu během pozdějších cyklů mohla být buď metabolická zátěž buněk způsobená opakovaným vystavením vysokým hladinám AI-1, nebo snížená hladina substrátu či živin. Důležité je, že úpravou našeho modelu tak, aby se vliv AI-1 na rychlost růstu s časem snižoval (viz doplňková poznámka 2), jsme byli schopni přizpůsobit se našim experimentálním datům (obr. 7b, upravený model v plných čarách), aniž bychom zvýšili složitost modelu.

Shrnuto, náš systém společné kultivace reagoval podle návrhu bez ohledu na to, zda byl umístěn do média bez AI-2 nebo s vysokou hladinou AI-2. Naše výsledky navíc ukázaly kontrolovatelnou populační hustotu, která zahrnovala 40 až 80 % řídicích buněk. Také srovnání s naším původním modelem poskytlo náhled na to, jak se systém choval v tomto složitějším experimentálním uspořádání; zdálo se, že translační buňky produkují v průběhu času vyšší hladiny AI-1, zatímco u kontrolních buněk se zdálo, že změny rychlosti růstu regulované AI-1 se v průběhu času snižují.

Nakonec by tento model mohl poskytnout základ pro zkoumání in silico, jak by zde použité strategie pro autonomně regulované kultury (vyznačující se rychlostí růstu regulovanou signálem a nativní signalizací mezi buňkami) mohly být rozšířeny na jiné systémy, včetně uživatelsky regulovaných nebo programovatelných systémů, které by mohly být dynamicky řízeny. Například chemostatové kultury se od současného autonomního systému liší tím, že jejich výstupy jsou řízeny uživatelem zadanými vstupy, jako je například míra ředění. Jako první průchod jsme provedli simulace spolukultur pěstovaných v chemostatu přidáním standardních průtokových členů do dávkového modelu (doplňkový obr. 8, doplňkové tabulky 4 a 5). V některých případech jsme zjistili, že rychlost ředění definuje složení kultury v ustáleném stavu, které lze následně „vyladit“ v rozsahu omezeném rychlostí ředění. Tohoto „vyladění“ lze dosáhnout externí modulací signalizace mezi buňkami, například exogenním přidáním signálních molekul. Tyto případy ilustrují, jak může souhra našeho autonomního systému a dalších uživatelsky řízených systémů vést ke složitějším populačním trajektoriím. Naše simulační výsledky zde slouží jako koncepční rámec pro řízení složení konsorcií ve složitějších, uživatelem řízených systémech. Další diskuse o simulacích chemostatu jsou uvedeny v doplňkové poznámce 3.

.