Fosilizovaná kůže odhaluje koevoluci s peřím a metabolismem u opeřených dinosaurů a raných ptáků

Struktura fosilních měkkých tkání

Malé skvrny tkáně (0,01-0,4 mm2; obr. 1a-d a doplňkové obr. 2-6) jsou úzce spojeny s fosilním peřím (tj, obvykle do 500 µm od uhlíkatých zbytků peří, Doplňkové obr. 2e, g, j, k, o, s, t). Skvrny jsou definitivně z fosilní tkáně a neodrážejí povrchovou kontaminaci moderním materiálem při přípravě vzorku, protože jsou zachovány ve fosforečnanu vápenatém (viz níže „Tafonomie“); navíc několik vzorků vykazuje okraje, které jsou částečně překryty okolní matricí. Tkáně tedy jednoduše nepřilnuly k povrchu vzorku v důsledku kontaminace částicemi ze vzduchu v laboratoři.

Skvrny tkáně jsou obvykle 3-6 µm silné a rovinné (obr. 1a-e). Příčné řezy a zlomy ukazují vnitřní vláknitou vrstvu (1,0-1,2 µm silnou) mezi dvěma tenčími bezstrukturními vrstvami (0,2-0,5 µm silnými) (obr. 1f-h). Vnější povrch bezstrukturní vrstvy je hladký a může vykazovat jemnou polygonální strukturu definovanou polygony o šířce 10-15 µm (obr. 1e, h).

Vláknitá vrstva rovněž vykazuje polygony (obr. 1f, h a 2a-e a doplňkový obr. 6), které obsahují pole hustě nabalených vláken o šířce 0,1-0,5 µm (obr. 2f-i a doplňkový obr. 5f). Dobře zachovaná vlákna vykazují helikoidální zkroucení (obr. 2h, i). Vlákna v okrajových částech každého polygonu jsou široká 0,1-0,3 µm a orientovaná rovnoběžně s povrchem tkáně; vlákna ve vnitřní části každého polygonu jsou široká 0,3-0,5 µm a jsou obvykle kolmá k povrchu tkáně (obr. 2b, h a doplňkový obr. S6d). V okrajových 1-2 µm každého polygonu jsou vlákna obvykle kolmá k laterálnímu okraji polygonu a končí na spojnici mezi sousedními polygony nebo ji přemosťují (obr. 2f, g a doplňkový obr. 6e). Polygony jsou obvykle rovnoměrné, ale jsou lokálně protáhlé a vzájemně vyrovnané, přičemž silná vlákna v každém polygonu jsou subparalelní s povrchem tkáně a tenká vlákna paralelní s okrajem polygonu (obr. 2j, k a doplňkový obr. 6g-l). Některé polygony vykazují centrální prohlubeň (obr. 2c-e a doplňkový obr. 6a-c), ve které mohou silná vlákna obalovat kulovitou strukturu širokou 1-2 µm (obr. 2e).

Fosilní korneocyty

Struktura těchto fosilních tkání se liší od struktury schránek konchostrakanů a rybích šupin z hostitelského sedimentu, schránek moderních Mytilus, moderních a fosilních opeřenců a epidermis moderních plazů (doplňkový obr. 7a-n). Protáhlá geometrie některých polygonů (obr. 2j, k a doplňkové obr. 6g, l) naznačuje pružnou deformaci nebiomineralizované tkáně v důsledku mechanického namáhání. Na základě jejich velikosti, geometrie a vnitřní struktury jsou polygonální struktury interpretovány jako korneocyty (epidermální keratinocyty). U moderních amniot se jedná o polyedrické zploštělé buňky (1-3 µm × cca 15 µm) vyplněné keratinovými tonofibrilami, lipidy a matrixovými proteiny18,19,20 (obr. 3a, b a doplňkové obr. 2u-x, 8, 9). Vnější bezstrukturní vrstva fosilního materiálu odpovídá buněčnému okraji; je silnější než původní biologická předloha, tj. rohovinový obal buňky a/nebo buněčná membrána, což však není neočekávané a odráží diagenetické zarůstání fosforečnanem vápenatým (viz „Tafonomie“). Vlákna ve fosilních korneocytech jsou identifikována jako mineralizované tonofibrily: rovné, nevětvené svazky svrchně svinutých α-keratinových vláken o šířce 0,25-1 µm18,21 , které jsou hlavní složkou cytoskeletu korneocytů22 a jsou obaleny amorfními cytoskeletálními proteiny22. Ve fosiliích tenké tonofibrily často přiléhají k fibrilám sousední buňky (obr. 2g a doplňkový obr. 6e), lokálně však mohou překlenout hranici mezi sousedními buňkami (obr. 2f). Ten připomíná desmosomy, oblasti silného mezibuněčného spojení mezi moderními korneocyty23. Centrální kulovité struktury uvnitř fosilních korneocytů připomínají mrtvá buněčná jádra24 , stejně jako u korneocytů současných ptáků (ale ne současných plazů a savců)24 (doplňkový obr. 8). Polohu těchto pyknotických jader často naznačují prohlubně na povrchu korneocytů u extantních ptáků24 (obr. 3b); některé fosilní buňky vykazují podobné prohlubně (obr. 2c a doplňkový obr. 6a-c).

Tafonomie

Keratin je relativně rekalcitabilní biomolekula díky své silně zesíťované parakrystalické struktuře a hydrofobnímu nepolárnímu charakteru23. Replikace fosilních korneocytů ve fosforečnanu vápenatém je tedy poněkud neočekávaná, protože tento proces obvykle vyžaduje strmé geochemické gradienty charakteristické pro raný rozpad25 a obvykle se týká tkání náchylných k rozpadu, jako jsou svaly26 a tkáně trávicího ústrojí27. Rekalcitabilní tkáně, jako je kožní kolagen, však mohou být replikovány ve fosforečnanu vápenatém, pokud obsahují vlastní zdroj vápníku a zejména fosforečnanové ionty, které se uvolňují během rozpadu28. Korneocyty obsahují zdroje obou těchto iontů. Během terminální diferenciace se intracelulární koncentrace vápníku zvyšuje29 a α-keratinové řetězce jsou rozsáhle fosforylovány23. Dále jsou lipidová granula korneocytů30 bohatá na fosfor a fosfát31. Tyto chemické látky by se uvolňovaly při rozkladu granulí a vysrážely by se na zbývajícím organickém substrátu, tj. na tonofibrilách.

U žijících savců vyžadují hustě zabalená pole tonofibril pro svou stabilitu hojné proteiny interkeratinové matrix32. Tyto proteiny však ve fosiliích nejsou patrné. To není neočekávané, protože tyto proteiny jsou v dochovaných ptačích korneocytech33 vzácné a kriticky se vyskytují jako rozptýlené monomery34 a měly by nižší potenciál uchování než vysoce zesíťované a polymerizované keratinové svazky tonofibril. Vnější bezstrukturní vrstva fosilních korneocytů je silnější než pravděpodobná biologická předloha (předlohy), tj. rohovinový buněčný obal (vrstva lipidů, keratinu a dalších proteinů o tloušťce až 100 nm, která nahrazuje buněčnou membránu během terminální diferenciace34 ) a/nebo buněčná membrána. To může odrážet místní mikroprostředí příznivé pro vysrážení fosforečnanu vápenatého: během terminální diferenciace se na periferii vyvíjejících se korneocytů hromadí granule keratohyalinu, rozsáhle fosforylovaného proteinu35 s vysokou afinitou k vápenatým iontům36. Tloušťka vnější pevné vrstvy fosforečnanu vápenatého ve fosiliích a postupný přechod od ní k vnitřní vláknité vrstvě naznačují, že srážení fosforečnanu probíhalo od okrajů směrem do nitra korneocytů. Podle tohoto scénáře by dostupnost fosfátů v okrajových zónách buněk převyšovala množství potřebné k replikaci tonofibril. Další fosfát by se vysrážel jako fosforečnan vápenatý v intersticiálních prostorech mezi tonofibrilami a postupoval by směrem dovnitř od vnitřní strany buněčného okraje.

Vylučování kůže u opeřených dinosaurů a raných ptáků

U žijících amniot je tloušťka epidermální rohovité vrstvy obvykle 5-20 buněk (tloušťka se však u jednotlivých druhů a míst na těle liší38). Skvrny fosilních korneocytů jsou však silné jednu buňku (obr. 1f a doplňkové obr. 5c, 10). To spolu s konzistentní malou velikostí (<400 μm) skvrn a pozoruhodně vysokou věrností zachování neodpovídá selektivnímu zachování souvislého listu tkáně in situ. V menšině (n = 8) příkladů se kůže vyskytuje na okraji vzorku fosilních měkkých tkání, a mohla by tak potenciálně představovat menší fragment původně většího kusu fosilní kůže (se zbytkem kusu na fosilní desce). Ve většině příkladů je však celý obrys fragmentu kůže obsažen na okraji vzorku. Zkoumání okrajů různých vzorků při velkém zvětšení ukazuje, že vzorek a okolní sediment jsou často v naprosto stejné rovině (např. doplňkový obr. 10). I v případech, kdy je okraj vzorku kůže zakryt sedimentem, je nepravděpodobné, že by vzorek byl mnohem větší než zdánlivá velikost, protože fosilní kůže, která je téměř dokonale rovinná, tvoří přirozenou rovinu rozdělení.

Neexistuje žádný důkaz, že by dochovaná tloušťka kůže byla artefaktem preparace nebo eroze. Při štípání skalní desky rovina štípání často prochází měkkými tkáněmi nerovnoměrně a obnažuje struktury v různých hloubkách. U zde studovaných fosilií rovina štěpení obvykle prochází korneocyty (obnažuje jejich vnitřní strukturu) a jen zřídka podél vnější strany vrstvy korneocytů. Neexistují důkazy o odstranění více než jedné vrstvy korneocytů: FIB řezy ukazují zachování pouze jedné vrstvy a několik snímků SEM ukazuje úplné vertikální řezy zachovanou kůží (kde je patrný vztah s nad- a podkladovým sedimentem) s důkazem pouze jedné vrstvy korneocytů. V místech, kde rovina rozdělení fosilní desky prochází skvrnami tkáně, je odhalena vláknitá vnitřní výplň fosilních korneocytů. Topografie fosilních korneocytů se však liší podle polohy roviny štěpení, která se může lokálně měnit přes měkké tkáně v milimetrovém měřítku: korneocyty se mohou vyskytovat s vyvýšenými okraji a centrální prohlubní, nebo s prohloubenými okraji a centrální vyvýšenou zónou (obr. S9).

Velikost, nepravidelná geometrie a tloušťka skvrn korneocytů připomíná vyvržené vločky rohovité vrstvy (lupy podobné částicím39; obr. 3). U žijících ptáků se korneocyty vylučují jednotlivě nebo ve skvrnách o velikosti až 0,5 mm2 , které mohou být vtaženy do peří (obr. 3c, d a doplňkový obr. 2u, v). Popsané fosilie poskytují první důkazy o procesu svlékání kůže u bazálních ptáků a neptačích maniraptorních dinosaurů a potvrzují, že přinejmenším někteří neptačí dinosauři svlékali kůži v malých skvrnách40. Tento způsob svlékání je shodný se svlékáním moderních ptáků18 (obr. 3c, d) a savců20 a předpokládá kontinuální somatický růst. To kontrastuje s mnoha současnými plazy, např, lepidosaurů, kteří svlékají kůži vcelku nebo po velkých částech21, ale styl svlékání může být ovlivněn faktory, jako je strava a prostředí41.

Evoluční důsledky struktury fosilních korneocytů

Fosilní korneocyty vykazují klíčové adaptace, které se vyskytují u jejich protějšků u současných ptáků a savců, zejména jejich zploštělou polygonální geometrii a vláknitý obsah buněk odpovídající α-keratinovým tonofibrilám16. Dále fosilní tonofibrily (stejně jako u extantních příkladů22) vykazují robustní mezibuněčná spojení a tvoří souvislé lešení napříč korneocytárním listem (obr. 2b, c, j a doplňkový obr. 6). Naproti tomu korneocyty u extantních plazů obsahují homogenní hmotu β-keratinu (s dalšími proteiny přítomnými v buněčném obalu) a během vývoje se spojují a vytvářejí zralé β-vrstvy bez zřetelných buněčných hranic42. Zachování pyknotických jader ve fosilních korneocytech je výrazně ptačí rys, který se u moderních plazů nevyskytuje (viz však ref. 20).

Morfogeneze a diferenciace epidermis se u terapsidů a sauropsidů považuje za odlišnou31. Naše data podporují další důkazy, že společné epidermální znaky u ptáků a savců ukazují na konvergentní evoluci43 a naznačují, že obsah korneocytů bohatý na lipidy může být evolučně odvozeným znakem u ptáků a opeřených neptačích maniraptoranů. Evo-devo studie naznačují, že ptačí epidermis mohla vzniknout rozšířením kloubních oblastí v šupinaté kůži „protofeather „20 . Zatímco fosilní důkazy pro tento přechod chybí, naše data ukazují, že epidermis bazálních ptáků a neptačích maniraptorních dinosaurů již měla vyvinutý rozhodně moderní charakter, a to dokonce i u taxonů, které nebyly schopny poháněného letu. To nevylučuje možnost, že alespoň některé zde popsané epidermální znaky vznikly u bazálnějších teropodů, zejména tam, kde dochovaná kůže postrádá známky šupin (jako u Sciurumimus44). Zdokonalené genomické mechanismy modulace komplexní exprese keratinu v epidermis45 , terminální diferenciace keratinocytů a rozdělení syntézy α- a β-keratinu v kůži opeřenců32 byly pravděpodobně modifikovány současně s evolucí peří v blízkosti základny Maniraptora do konce střední jury (obr. 4). Existující fosilní data naznačují, že k tomu došlo po evoluci zobáku u Maniraptoriformes a před evolucí patagií a pterylů předních končetin (obr. 4); první fosilní výskyty všech těchto znaků pokrývají období cca 10-15 mil. let, což naznačuje prudký nárůst inovací v evoluci opeřeného integumentu v blízkosti a přes hranici spodní a střední jury. Nejstarší důkaz kožní svaloviny spojené s peřím je asi o 30 milionů let mladší, a to u ornitothoracea z doby před 125 miliony let17. Vzhledem k zásadní roli, kterou tato kožní síť hraje v podpoře peří a kontrole jeho orientace18 , může její absence u opeřených neavijských maniraptoranů odrážet tafonomickou odchylku.

V určitých aspektech jsou fosilní korneocyty výrazně neavianské a naznačují, že opeření dinosauři a raní ptáci měli jedinečnou integumentární anatomii a fyziologii přechodnou mezi anatomií moderních ptáků a neopeřených dinosaurů. U současných ptáků jsou tonofibrily korneocytů volně rozptýleny mezi intracelulárními lipidy19; to usnadňuje evaporační chlazení v reakci na produkci tepla během letu a izolaci opeřením46. Naproti tomu fosilní tonofibrily jsou hustě zabalené a vyplňují vnitřek buňky. Neexistují žádné důkazy o postmortálním smršťování fosilních korneocytů: rozsah velikostí odpovídá rozměrům u moderních ptáků a neexistují žádné důkazy o diagenetickém vrásnění, zkroucení nebo oddělení jednotlivých buněk. To silně naznačuje, že dochovaná hustota tonofilament ve fosilních korneocytech odráží původně vyšší hustotu než u současných ptáků. Nejedná se o funkci velikosti těla: současní ptáci rozdílné velikosti (např. zebřička a pštros) vykazují volně rozptýlené tonofibrily47. Fosilní ptáci tak měli pravděpodobně nižší fyziologické nároky na evaporační chlazení a následně nižší produkci tělesného tepla související s letovou aktivitou46 než moderní ptáci. To je v souladu s dalšími důkazy o nízkém bazálním metabolismu u neptačích maniraptorních dinosaurů47,48 a bazálních ptáků47 a s hypotézami, že peří Microraptora49 a případně Confuciusornise48 (viz však cit.50 ) nebylo přizpůsobeno k motorovému letu, alespoň po delší dobu50.

.