Dobrý den,
položil jsem svůj dotaz jinde, ale nedostal jsem odpověď, rád bych ho položil zde a omlouvám se, že to vypadá jako hloupý dotaz, protože jsem opravdu zmatený !
Někde jsem četl věc, která mě zmátla ohledně cDNA. Chtěl bych vědět, jestli je cDNA dvouvláknová nebo jednovláknová ?
Vím, že cDNA je kopie mRNA pomocí reverzní transkriptázy, takže teoreticky by měla být jednovláknová , je to tak nebo se mýlím ?
Děkuji za názor
položila jsem svůj dotaz jinde, ale nedostala jsem odpověď, ráda bych ho položila sem a, omlouvám se, že to vypadá na hloupý dotaz, protože jsem opravdu zmatená !
Někde jsem četla věc, která mě zmátla ohledně cDNA. Chtěl bych vědět, jestli je cDNA dvouvláknová nebo jednovláknová ?
Vím, že cDNA je kopie mRNA pomocí reverzní transkriptázy, takže teoreticky by měla být jednovláknová , je to tak nebo se mýlím ?
Děkuji za zpětnou vazbu
Ve většině případů, například pro RT-PCR, 3′ nebo 5′ RACE, používáme pouze jednovláknovou cDNA (první vlákno cDNA), zatímco v případě přípravy cDNA pro konstrukci knihovny nebo RDA/SSH analýzu, která může vyžadovat další krok syntézy druhého vlákna pro vytvoření dvouvláknové cDNA.
hi
musíte rozlišovat 2 věci :
CDNA obecně je molekula DNA odpovídající zhruba seuqenci mRNA. Je to tedy dvouvláknová molekula obsažená v plazmidu pro expresi ve většině případů.
RT PCR : molekula mRNA je reverzně přepsána do jednovláknové cDNA. Po tomto okamžiku RNáza eliminuje molekulu mRNA a získáte jednovláknovou molekulu cDNA. Protože dalším krokem je zcela klasická PCR, jednořetězcová molekula je pro exp v pořádku (a první krok, který odpovídá sysntéze odpovídajícího druhého řetězce molekuly DNA, obnovuje skutečnou molekulu cDNA.
Pravda, cDNA je dvouřetězcová molekula, ale pro pohodlí se cDNA používá také pro návrh reverzně přepsané molekuly RTPCR. Měla by být pojmenována jako poloviční cDNA nebo jednovláknová cDNA.
CDNA je zkrácený název.
zatímco ve většině případů je cDNA, zkratka komplementární DNA, definována jako jednořetězcová molekula DNA s nukleotidovou sekvencí, která je komplementární k molekule RNA a je syntetizována v laboratoři z mRNA reverzní transkripcí….
Takže cDNA je jednovláknová, dokud není provedena reakce PCR ? Dobře, jak v tomto případě Taq DNA polymeráza vytvoří druhé komplementární vlákno z jediného ? Když se dva primery žíhají na každé straně stejného vlákna, jak mohou vytvořit druhé vlákno (nové komplementární) ?
Při PCR se jeden primer váže na jeden jednovláknový kousek DNA (proto je prvním krokem vždy dentura při 94C(nebo tak nějak), aby se případné dvouvláknové molekuly rozdělily na jedno vlákno. V případě prvovláknové cDNA z RT reakce se v prvním kole váže pouze jeden primer… To znamená, že první kolo amplifikace při RT-PCR není logaritmické, jednoduše syntetizujete druhé vlákno cDNA. V dalších kolech (kolo 2 až kolo n) dochází k logritmické amplifikaci, protože se na denaturovaný dvouřetězcový templát vážou oba primery – dopředný i reverzní.
V prvním kole se podle mého názoru váže dopředný primer… Myslím, že je to proto, že mRNA=přední vlákno v genomu a první vlákno cDNA=komplement mRNA (nebo je stejné jako reverzní vlákno v genomu)
Zkontroluje někdo moji logiku, pletu si to… je to správně, že mRNA je komplementem reverzního vlákna genomové DNA?
tj. sekvence mRNA=přední vlákno=sekvence 5′-3′ v gDNA (jen s U, ne s T)???
HTH
Děkuji za vše, už je mi to jasnější.
Myslím, že ano, dokud nenarazí na intron, že ? 
Můžeme zkontrolovat jakoukoli vaši známou sekvenci mRNA v NCBI, obnovit genomický hit a porovnat sekvence, abychom zjistili, zda je to pravda nebo ne.
Jo, to je pravda, museli byste vynechat introny 
Zní to jako dobrý způsob testování, zkusím to později, pokud budu mít příležitost, a dám vám vědět… čím víc o tom přemýšlím, sekvence mRNA = sekvence předního vlákna musí být správně…
Díky! 