Laboratorní detekce a identifikace druhů Aspergillus mikroskopickým pozorováním a kultivací: tradiční přístup

Abstrakt

Molekulární a imunologické testy slibují lepší a rychlejší laboratorní diagnostiku aspergilózy, ale mikroskopie a kultivace zůstávají běžně používanými a nezbytnými nástroji. Procedurální změny, stejně jako odpovídající školení laboratorních pracovníků, mohou zvýšit hodnotu těchto tradičních nástrojů. Používání Blankophoru nebo Calcofluoru pro mikroskopická vyšetření; zlepšení rozpoznávání morfologických charakteristik oportunních hub v obarvených nátěrech vzorků; maximalizace rychlosti růstu a produkce konidií Aspergillus spp. v kultuře; a rozpoznávání atypických variant běžných aspergilů může zlepšit přínos laboratoře k rychlé diagnostice. Průzkumy ukazují, že počet laboratorních pracovníků klesá, protože poptávka po zdravotní péči roste. Efektivní nábor, udržení a školení personálu musí probíhat současně s technologickým pokrokem.

Úvod

Tradiční metody diagnostiky aspergilózy a dalších mykóz jsou doplňovány molekulárními a imunologickými přístupy. Přestože výhody testů založených na nukleových kyselinách jsou zřejmé, jejich standardizace a klinická využitelnost nebyly plně realizovány . Navíc zatímco galaktomananový EIA test na antigen Aspergillus je v USA široce dostupný, standardní využití testů na bázi nukleových kyselin pro identifikaci klinických izolátů se zdá být omezené. Mezi referenční laboratoře nabízející molekulární identifikaci aspergilů patří Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Nizozemsko, a laboratoře v USA uvedené v online adresáři testů Association for Molecular Pathology. Přestože se molekulární metody stále zdokonalují a stávají se dostupnějšími, mikroskopie a kultivace zůstávají hlavními laboratorními nástroji pro detekci aspergilů. Srovnávací průzkum Americké mikrobiologické společnosti (ASM) z roku 2003 doložil, že 89 % laboratoří provádějících mykologické testy používá kultivaci, 16 % sérologii a méně než 5 % molekulární testy. Pouze 3 % vykazujících laboratoří používají „domácí“ molekulární testování mikrobiálních patogenů. Vzhledem k přetrvávajícímu spoléhání na mikroskopii a kultivaci je třeba zlepšit diagnostickou hodnotu těchto metod pomocí procedurálních změn a odpovídajícího školení laboratorního personálu.

Mikroskopie

Mikroskopické metody, jako jsou mokré nátěry, barvení podle Grama a konvenční histopatologie, poskytují vodítka, která naznačují přítomnost Aspergillus spp. ve tkáni. Blankofor nebo Calcofluor ve směsi s 10-20% hydroxidem draselným (KOH), barví buněčné stěny hub a zlepšuje detekci hub. Zatímco Calcofluor krystalizuje v alkalickém pH, Blankophor nekrystalizuje a může být skladován v pracovním roztoku až rok . Fenotypové markery zjištěné histopatologickým barvením, stejně jako barvením podle Grama nebo mokrým nátěrem, poskytují cenné informace o klinicky významných houbách, zejména při absenci kultivace (tabulka 1). Potvrzení mikroskopických nálezů kultivací je však vždy žádoucí a ve většině případů týkajících se oportunních plísní nezbytné pro definitivní identifikaci patogenu. Navzdory přítomnosti vizuálních vodítek může být identifikace aspergilií pouze pomocí mikroskopie zavádějící. Schell uvádí případ sinusitidy způsobené Aspergillus niger, kdy byly konidie A. niger zaměněny za kvasinkové buňky Candida spp. a příčné řezy stipes A. niger byly zaměněny za široké hyfy zygomycet. Komunikace mezi klinickým patologem a laboratorním mykologem, který běžně identifikuje vláknité houby z kultury, může zlepšit diagnostickou hodnotu histopatologie.

Rozpoznání morfologických charakteristik

Jelikož jsou aspergily v přírodě všudypřítomné, mohou běžně kontaminovat vzorky a kultivační média. V důsledku toho je určení významu Aspergillus spp. rostoucích v kultuře často problémem, pokud je mikroskopické vyšetření vzorku negativní. V průzkumu izolátů Aspergillus od příjemců transplantovaných jater a ledvin Brown et al. zjistili, že přítomnost více než dvou kolonií v kultuře a infekce na více než jednom místě předpovídá významnou infekci. U granulocytopenických pacientů s akutní leukémií musí být jediná izolace ze vzorku z dolních dýchacích cest považována za významnou . Jednoznačné hlášení laboratorních pozorování lékaři může snížit diagnostické dilema. Například sdělení: „Celkem tři kolonie Aspergillus fumigatus izolované na dvou ze tří destiček“ poskytuje více informací než „Izolován vzácný A. fumigatus“.

Optimalizace výsledků kultivace

Isolace v kultuře a fenotypová identifikace běžných klinických izolátů Aspergillus spp. je obvykle rychlá a snadná. Kultivace je však často popisována jako pomalá, což možná vytváří mylné představy o její hodnotě pro detekci aspergilů. A. fumigatus rychle roste. Typické velutinové, šedomodrozelené kolonie a jednosemenné hlavičky konidií se vyvíjejí během 24-48 h jak na houbových médiích, tak na agaru z ovčí krve, který se běžně používá pro kultivaci bakterií. Ostatní aspergily spojené s invazivní aspergilózou, konkrétně A. flavus, A. niger, A. nidulans a A. terreus, mají podobnou rychlost růstu jako A. fumigatus, když byly kolonie měřeny na agaru se sladovým extraktem a na Čapkově kvasničném agaru po sedmidenní inkubaci při 25 °C i 37 °C . Protože hrozí rezistence některých druhů rodu Aspergillus k léčivům, je třeba provést úplnou identifikaci nejen A. fumigatus, ale i méně často izolovaných druhů. Laboratorní vědci musí také rozpoznat atypické izoláty Aspergillus spp. Nedávno byly hlášeny špatně sporulující (bílé) kmeny A. fumigatus se sníženou citlivostí k několika antimykotikům . Tyto bílé kmeny mají genetickou sekvenci odlišnou od divokého typu A. fumigatus Fresenius a nevytvořily typické modrozelené hlavičky konidií do 10-12 dnů po inkubaci. Dalším problémem je bílá plíseň Neosartorya fisheri, která zpočátku vytváří řídké konidiové hlavičky připomínající hlavičky A. fumigatus. N. fisheri však následně vytváří četná, kulatá, tenkostěnná kleistothecia, což usnadňuje odlišení od A. fumigatus. Pro rychlou lokalizaci konidiálních hlaviček a cleistothecií je vhodný pitevní dalekohled. Mohou se vyskytnout sterilní, bílé, rychle rostoucí nebo lysé, kopcovité, pomalu rostoucí izoláty A. fumigatus, které vyžadují pro definitivní identifikaci vyšetření termotolerance a exoantigenu . Khan et al. zaznamenali atypický A. terreus izolované ze vzorků z dolních cest dýchacích pacienta s aspergilomem. Počáteční kolonie byly oranžové a produkovaly difuzní žlutý pigment a malé, jednotlivé buňky, které byly zaměněny za konidie Scedosporium apiospermum. Precipitující protilátky a typické hlavičky konidií A. terreus produkované po 10 týdnech inkubace potvrdily identifikaci.

Obrázky a informace dostupné v učebnicích a na internetu nabízejí dobré výukové možnosti pro výuku identifikace Aspergillus spp. Nejúčinnějším výukovým nástrojem však zůstává praktická zkušenost. CDC, National Laboratory Training Network (NLTN) a CBS nabízejí laboratorní semináře. Pokud není praktické cestovat mimo pracoviště, doporučujeme laboratořím, aby pro interní školení používaly online výukový program Aspergillus Reference Cultures (Referenční kultury Aspergillus). Referenční organismy tam uvedené je možné zakoupit ve významných sbírkách kultur.

Analýza každého kroku kultivačního postupu může vést ke zlepšení výtěžnosti aspergilů. Zkapalnění vzorků pomocí sputolysinu nebo jiných mukolytických látek bylo navrženo pro obnovu hub zachycených v hlenu sputa a materiálu z dutin získaných při endoskopickém zákroku . Použití bramborové dextrózy, bramborových vloček, sladového extraktu, inhibičního plísňového agaru nebo podobných sporulačních agarů jako primárních izolačních médií pro Aspergillus spp. může urychlit rychlost růstu a produkci konidií. Přidání antibakteriálních látek do izolačních médií pomáhá zkrátit dobu identifikace tím, že inhibuje přerůstání bakterií a snižuje potřebu subkultivace. Počáteční inkubace houbových médií při 35-37 °C namísto nebo navíc k 30 °C může urychlit růst některých aspergilií. Podobně každodenní kontrola kultivačních médií zajišťuje co nejrychlejší detekci. Inkubací kultivačních misek v mikroaerofilním prostředí při 35 °C Tarrand zjistil, že vybrané, klinicky významné Aspergillus spp. rostou z 12 z 12 bujónových kultur. Kultury stejných organismů inkubované při 25 °C bez CO2 nepřinesly žádné pozitivní výsledky. Další studie by byly užitečné pro objasnění médií a podmínek, které jsou nejúčinnější pro obnovu a rychlou identifikaci klinicky významných aspergilů.

Pomocí rychlé montáže skotskou páskou nebo tease mount lze obvykle identifikovat hlavičky konidií Aspergillus spp. Při pomalé nebo netypické sporulaci však může být nutná kultivace na sklíčku. Rychlé tempo většiny nemocničních laboratoří diktuje nejjednodušší, i když ne nutně nejdokonalejší metodu pro provedení kultivace na sklíčku. Riddellova klasická metoda kultivace na sklíčku byla doplněna dalšími, méně pracnými technikami . Rychlá metoda spočívá v jednoduchém zatlačení krycího sklíčka o rozměrech 18 × 18 mm pod úhlem 45 stupňů do sporulačního média, jako je bramborový vločkový agar. Když plíseň sporuluje, krycí sklíčko se opatrně vyjme z agaru a na mikroskopickém sklíčku se namontuje do kapky lakto-fenolové modři nebo lakto-fuchsinu. Před dokončením montáže s krycím sklíčkem o rozměrech 22 × 22 mm se na malé krycí sklíčko umístí další kapka.

Problematika pracovních sil

Rychlá diagnostika aspergilózy závisí nejen na zdokonalené metodice, ale také na odpovídajícím, dobře vyškoleném personálu. Průzkumy mykologických praxí důrazně doporučují více školení . Zvláštní důraz by měl být kladen na přesnou identifikaci, přímé vyšetření, vhodné použití médií, klinickou relevanci a nákladovou efektivitu. Nedostatečné personální zajištění však může ohrozit jak školení, tak provádění klinicky relevantnějších postupů. Srovnávací průzkum ASM odhalil přetrvávající nedostatek pracovních sil v některých mikrobiologických laboratořích v USA. Tento nedostatek je částečně důsledkem 53-56% snížení počtu školicích programů CLS za posledních 12 let. Třicet čtyři procent odborníků pracujících v mikrobiologických laboratořích je dnes starších 50 let. Budou k dispozici mladší pracovníci, kteří je nahradí, až odejdou do důchodu? Zatímco téměř 80 % žen v pracovním poměru je mladších 30 let, pouze 10 % pracovnic v mikrobiologických laboratořích je mladších 30 let . Tyto údaje naznačují, že nedostatek pracovních sil bude přetrvávat a možná se ještě prohloubí.

Závěr

Zlepšení tradičních i netradičních diagnostických postupů u mykóz vyžaduje souběžné úsilí o zajištění dostatečného počtu pracovních sil a zlepšení kariérní mobility, profesního uznání, možností dalšího vzdělávání, odměňování a dalších faktorů potřebných ke stimulaci zájmu o laboratorní vědu.