Nádorové xenotransplantáty

Charakterizace bank xenotransplantátů

Práce s nádory PDX vyžaduje vytvoření a udržování banky nádorů, které jsou implantovány myším a poté sériově přenášeny z generace na generaci, pokud tento řetězec událostí není přerušen zmrazením vzorků. Předpokládá se, že PDX reprodukují morfologické charakteristiky původního nádoru přesněji než xenografty zavedených buněčných linií, pokud jde o histologické a genetické profily. Reprodukují heterogenitu lidských nádorů a mají lepší vypovídací hodnotu pro předpověď odpovědi na léčbu.8-16

Zánětlivé léze jsou obecně snadno identifikovatelné histologickými metodami. Naproti tomu u nádorů může být obtížnější určit, zda se jedná o očekávaný nádor, nebo zda má jiný původ. Nádory u myší se totiž mohou vyvinout v místě xenograftu. Většina takových nádorů jsou lymfomy (obr. 4.2B)11 , ale někdy jsou pozorovány sarkomy z fusiformních buněk (obr. 4.2C) a ve vzácných případech lze pozorovat i jiné myší nádory, například nádory mléčné žlázy v podkoží myších samic. Spontánní nádory nebo nádorovité léze mohou vznikat i ve vzdálených orgánech a mohou být mylně interpretovány jako možné metastázy (např. plicní adenomy; obr. 4.2D). Jednoduché morfologické vyšetření tkáně obvykle jasně ukazuje, zda se jedná o stejný typ nádoru jako původní lidský nádor. To platí zejména pro většinu xenotransplantátů karcinomů, které mají morfologii velmi odlišnou od lymfomů nebo sarkomů. Karcinomy jsou obecně tvořeny velkými buňkami, zřetelně uspořádanými do provazců, tubulů nebo lobulů s výrazným vazivovým intersticiem. Lymfomy (ať už lidské nebo myší) se skládají z plátů malých kulatých buněk s řídkým stromatem a sarkomy se skládají z proudů splývajících buněk. Proto je snadné tyto různé typy nádorů okem rozlišit. Diagnostika může být obtížnější, pokud je původní nádor „modrý nádor“, tedy nádor tvořený malými buňkami s velmi malým množstvím cytoplazmy a hyperchromatickým jádrem, který se pod mikroskopem při malém zvětšení po barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) jeví jako hluboce bazofilní (modré barvy). Blastické nádory, jako je retinoblastom, jsou typicky modré nádory. V takových případech může být obtížné interpretovat morfologii nádoru, zejména proto, že nejspecifičtější charakteristiky některých nádorů, jako jsou rozety mnoha blastických nádorů, v xenogramech obecně chybí nebo jsou zastoupeny nedostatečně. Anaplastické nádory, u nichž se nádorové buňky jen málo nebo vůbec nepodobají morfologicky normálním buňkám, lze rovněž obtížně charakterizovat bez pomocných technik. Jak již bylo uvedeno, zatímco je relativně snadné odlišit sarkom od lymfomu nebo dobře diferencovaného karcinomu, odlišení xenograftu sarkomu od zánětlivých lézí nebo myších sarkomů může být náročné, protože tyto léze mohou mít velmi podobnou morfologii.6

Pokud se jedná o obtížné případy nebo pokud je třeba před zahájením experimentu jednoduše potvrdit, že nádor je skutečně lidského původu, lze k identifikaci lidských nebo myších buněk použít několik různých metod určených k odhalení druhově specifických proteinů nebo nukleotidových sekvencí, založených na imunohistochemii nebo hybridizaci in situ. Imunohistochemická charakterizace proteinů charakteristických pro buněčnou linii je užitečná pro upřesnění tkáně původu nádoru.

Zvláštní pozornost je třeba věnovat možnému vzniku lidských lymfomů v místě přihojení nelymfoidních nádorů, většinou během počáteční implantace.11 Takové nádory nesou specifické markery lidských buněk; to může vést k záměně se skutečným xenograftem, pokud není provedeno morfologické vyšetření léze. Ve studiích PDX se zdá, že většina pozorovaných lidských lymfomů se vyvinula z lymfocytů přítomných ve vzorku tkáně použitém k počátečnímu přihojení. Pokud jsou tyto buňky infikovány virem Epsteina-Barrové (EBV), mohou lymfocyty B projít transformací a stát se nádorovými buňkami.17,18 Tyto buňky jsou u imunokompetentních lidí účinně eliminovány imunitním systémem, zatímco jejich přihojení u imunokompromitovaných myší umožňuje rozvoj maligních buněk B a jejich nahrazení původním lidským nádorem.11 V kontextu PDX bylo popsáno také několik případů EBV negativních periferních lidských T-buněčných lymfomů.19 Pokud byl původní lidský nádor jasně odlišný od lymfomu (např. adenokarcinom), pak je vývoj lidského lymfomu snadno zvládnutelný, protože stačí jednoduché morfologické vyšetření, které ukáže, že nádor rostoucí v místě vštěpení není očekávaného typu, a měl by být proto vyřazen. Pokud byl původní nádor „modrý nádor“, pak prokázání, že nádor nalezený v místě přihojení je lidského původu, může při absenci další charakterizace vést k nesprávné interpretaci, protože tento nádor může být ve skutečnosti lidský lymfom vzniklý maligní transformací lymfocytů infikovaných EBV přítomných v původním nádoru, jak bylo uvedeno výše.

Když je xenotransplantát vytvořen (PDX nádory jsou obecně považovány za stabilizované po třech až pěti pasážích20), měl by být charakterizován, a to jak z hlediska jeho histologického typu, tak z hlediska jeho diferenciace. Histologický typ nádoru je v xenografech obecně dobře zachován, takže například epidermoidní karcinomy a tubulární adenokarcinomy mají při tvorbě PDX stejné vlastnosti.21 Předpokládá se, že tato fenotypová stabilita souvisí s biochemickou stabilitou, protože výrazné biochemické změny by pravděpodobně nevedly k zachování morfologických vlastností.6 První otázkou, kterou musí patolog řešit, je tedy to, zda přítomný nádor reprodukuje morfologické a biochemické charakteristiky mateřské tkáně.17 Pokud tomu tak není, pak může odpovídat myšímu nádoru, nebo mohlo dojít k zásadní změně ve vzorci diferenciace nádoru, což by vyžadovalo další zkoumání.8

U některých transplantátů první generace a stále častěji po dalších pasážích však mohou mít některé nádory tendenci být méně diferencované, s menším počtem kanálků nebo acinů u adenokarcinomů a větší mírou mitóz, jaderného pleomorfismu a atypií.20

Specifické morfologické detaily se mohou během sériových pasáží měnit, například s nabytím sekrece mucinu nebo neuroendokrinní diferenciace, což jsou obě kritéria progrese nádoru u některých karcinomů (např. karcinomů prostaty).22 Podobně může být vzorec diferenciace nádoru změněn modifikací podmínek přihojení, například se změnami hormonálního stavu hostitele v důsledku kastrace nebo hormonální suplementace.22

Jedním z problémů, se kterými se patologové potýkají, je určení, zda je morfologie nádoru zachována po engraftmentu, sériových pasážích nebo experimentech. Nezávislé xenografty z téhož nádoru totiž nikdy nejsou striktně identické kvůli biologické variabilitě a intratumorózní heterogenitě. Dokonce i různé řezy stejného nádoru a různé oblasti stejného řezu mohou vykazovat morfologické rozdíly. Morfologické charakteristiky buněk a jejich jader, jejich prostorové uspořádání, mitotický index a přítomnost atypických mitóz, počet apoptotických tělísek a četnost nekróz, množství stromatu a vaskulatury se liší mezi jednotlivými řezy i mezi jednotlivými poli. Patolog proto musí určit, zda je zachován celkový obraz nádoru, a co je důležitější, zda histologie xenotransplantovaného nádoru odpovídá histologii původního dárcovského nádoru. Jako základ přesné patologické klasifikace xenotransplantátů by se měly používat mezinárodní klasifikace lidských nádorů, ale je nutná určitá míra flexibility, protože xenotransplantáty nikdy dokonale nereprodukují morfologii původního lidského nádoru.

Při sledování xenografů v průběhu po sobě jdoucích pasáží nebo během experimentů lze kvalitativní změny, jako je přechod od trabekulárního k tubulárnímu vzoru, pokud jsou reprodukovatelné, považovat za významné, zatímco kvantitativní změny, jako jsou změny mitotického indexu nebo množství nekróz, zejména pokud jsou jemné, by měly být interpretovány s velkou opatrností.

Další obtíž při histologických analýzách xenobank nádorů vyplývá z částečně subjektivní povahy morfologické analýzy. Pokud pozorovatelé dobře znají morfologii určitého typu nádoru, pak je jejich vnímání jemně vyladěno na odhalování drobných detailů, které se mohou časem stát zřetelnějšími. Aby bylo zajištěno co nejobjektivnější čtení preparátů, je vhodné vybrat vzorek stabilizovaného PDX, který se použije jako referenční pro srovnání s novými vzorky. Digitální banka virtuálních preparátů může tento úkol značně usnadnit. Pokud nelze zjistit žádný zjevný rozdíl mezi testovacím a referenčním preparátem, pak lze lézi považovat za „podobnou“; to neznamená, že jsou identické, pouze že nelze zjistit žádné významné morfologické změny.

Pro první vzorek pozorovaný v experimentu s xenotransplantátem by měl být referenčním vzorkem původní lidský nádor nebo by měl mít alespoň morfologický popis jako příslušný nádor v patologické zprávě pacienta. Pokud taková reference není k dispozici, může patolog jednoduše říci, že nádor je „morfologicky kompatibilní“ s xenotransplantátem lidského nádoru dané kategorie

.