Proteiny

Lysozym byl prvním enzymem, u kterého byla určena rentgenová struktura s vysokým rozlišením. To se podařilo v roce 1965 Davidu Phillipsovi, který pracoval v Královském institutu v Londýně. Phillips dále navrhl mechanismus působení lysozymu, který byl založen především na strukturních údajích. Phillipsův mechanismus byl od té doby potvrzen experimentálními důkazy, jak uvidíme později.

Lysozym se hojně vyskytuje v buňkách a sekretech (včetně slz a slin) obratlovců a vaječný bílek slepic je na tento enzym obzvláště bohatý. Lysozym katalyzuje hydrolýzu glykosidických vazeb, které spojují kyselinu N-acetylmuramovou (NAM) a N-acetylglukosamin (NAG) v polysacharidech bakteriálních buněčných stěn. Tím narušuje integritu buněčné stěny a působí tak jako bakteriocidní látka. Vazba NAM-NAG je znázorněna na obrázku 40 s vyznačeným místem štěpení lysozymem.

Obrázek 40 Část polysacharidové složky bakteriálních buněčných stěn, na níž jsou znázorněny střídající se zbytky N-acetylmuraminové kyseliny (NAM) a N-acetylglukosaminu (NAG). Tento polysacharid je substrátem pro lysozym, který hydrolyzuje glykosidickou vazbu v uvedené poloze. (Pro přehlednost a umožnění lineárního znázornění molekuly jsou některé vazby zobrazeny klikatě)

Lysozym je poměrně malý enzym. Lysozym ze slepičího vaječného bílku se skládá z jediného polypeptidu o délce 129 aminokyselin (obrázek 41) s Mr 14 600. Tento polypeptid se skládá ze dvou částí. Z rentgenových difrakčních dat je patrné, že ve struktuře lysozymu je zřetelný rozštěp (obrázek 42). Aktivní místo se nachází v této štěrbině. V sekvenci aminokyselin na obrázku 41 a v prostorovém modelu lysozymu na obrázku 42 jsou zvýrazněna ta rezidua, která lemují substrátovou vazebnou kapsu ve složeném proteinu.

Obrázek 41 Sekvence aminokyselin lysozymu slepičího vaječného bílku se zbytky, které lemují substrátovou vazebnou kapsu, zvýrazněnými šedě. Asp 52 a Glu 35, klíčová rezidua v aktivním místě, jsou zvýrazněna červeně, resp. žlutě.

Obrázek 42 Model lysozymu slepičího bílku vyplňující prostor, ve kterém byla zvýrazněna klíčová rezidua. Asp 52 je červeně; Glu 35 je žlutě; některá rezidua lemující substrátovou vazebnou kapsu jsou znázorněna šedě.

Aktivní místo lysozymu je dlouhá drážka, která může pojmout najednou šest cukrů polysacharidového řetězce. Po navázání polysacharidu enzym hydrolyzuje jednu z glykosidických vazeb. Pokud je šest cukrů v úseku polysacharidu označeno jako A-F, místo štěpení se nachází mezi D a E, jak je uvedeno na obrázku 40. Poté se uvolní dva polysacharidové fragmenty. Na obrázku 43 jsou znázorněny fáze této reakce, které jsou také podrobně popsány níže.

Obrázek 43 Katalytický mechanismus lysozymu. Všimněte si, že jsou zobrazena pouze klíčová rezidua zapojená do katalýzy (Glu 35 a Asp 52). Jednotlivé fáze jsou podrobně popsány v textu. (Založeno na Phillips, 1966)

1. Po navázání na enzym zaujme substrát napjatou konformaci. Reziduum D je deformováno (v diagramu není znázorněno), aby se do něj vešla skupina -CH2OH, která by jinak měla nepříznivý kontakt s enzymem. Tímto způsobem enzym nutí substrát zaujmout konformaci blížící se konformaci přechodného stavu.

2. Reziduem 35 enzymu je kyselina glutamová (Glu 35) s protonem, který snadno přenáší na polární atom O glykosidické vazby. Tímto způsobem se štěpí vazba C-O v substrátu (obr. 43a a b).

3. Reziduum D polysacharidu má nyní čistý kladný náboj; tento reakční meziprodukt je znám jako oxoniový ion (obr. 43b). Enzym stabilizuje tento meziprodukt dvěma způsoby. Za prvé, blízký aspartátový zbytek (Asp 52), který je v záporně nabité karboxylátové formě, interaguje s kladným nábojem oxoniového iontu. Za druhé, distorze zbytku D umožňuje sdílení kladného náboje mezi jeho atomem C a O. (Všimněte si, že toto sdílení náboje mezi atomy se označuje jako rezonance stejně jako sdílení elektronů mezi atomy peptidové skupiny). Meziprodukt oxoniového iontu je tedy přechodným stavem. Za normálních okolností by byl takový meziprodukt velmi nestabilní a reaktivní. Asp 52 pomáhá stabilizovat oxoniový ion, ale nereaguje s ním. Je to proto, že ve vzdálenosti 3 Å jsou reaktivní skupiny příliš daleko od sebe.

4. Enzym nyní uvolňuje zbytek E s připojeným polysacharidem, čímž vzniká glykosyl-enzymový meziprodukt. Oxoniový ion reaguje s molekulou vody z prostředí rozpouštědla, extrahuje hydroxylovou skupinu a znovu protonuje Glu 35 (obr. 43c a d).

5. Enzym poté uvolní zbytek D s připojeným polysacharidem a reakce je dokončena.

Výše uvedený Phillipsův mechanismus katalýzy lysozymu je podpořen řadou experimentálních pozorování. Zejména význam Glu 35 a Asp 52 v tomto procesu byl potvrzen experimenty s mutagenezí řízenou na místě (SDM). SDM je velmi účinná technika pro zkoumání úlohy jednotlivých aminokyselinových zbytků ve funkci proteinu a bude podrobněji popsána v oddíle 7.2. SDM zahrnuje použití technologie rekombinantní DNA k selektivnímu nahrazení požadovaného zbytku jinou aminokyselinou s kriticky odlišnými vlastnostmi. Výsledný protein lze poté funkčně testovat, např. s ohledem na vazbu substrátu nebo katalytickou aktivitu. Když byla tato technika použita u lysozymu k nahrazení Glu 35 zbytkem glutaminu (Gln), výsledný protein mohl stále vázat substrát (i když méně silně), ale neměl katalytickou aktivitu. Glu 35 je tedy pro katalytickou aktivitu lysozymu nezbytný. Když byl Asp 52 nahrazen zbytkem asparaginu (Asn), měl mutantní protein méně než 5 % katalytické aktivity normálního (divokého) lysozymu, přestože mutantní forma měla ve skutečnosti dvakrát vyšší afinitu k substrátu. Z toho vyplývá, že Asp 52 je pro katalytickou aktivitu lysozymu nezbytný. Pokusy s použitím chemických látek, které kovalentně modifikovaly tato rezidua, aniž by významně ovlivnily rentgenovou strukturu, podobně prokázaly, že jsou pro katalytickou aktivitu nezbytná

.