Relationship between the Size of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Reservoir in Peripheral Blood CD4+ T Cells and CD4+:CD8+ T buněk u aviárních jedinců infikovaných HIV-1, kteří dostávají dlouhodobou vysoce aktivní antiretrovirovou léčbu

Abstrakt

Ukázalo se, že replikace viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) přetrvává u většiny infikovaných jedinců, kteří dostávají vysoce aktivní antiretrovirovou léčbu (HAART). Studie zabývající se vztahem mezi nízkou úrovní probíhající virové replikace a imunologickými parametry, jako je poměr CD4+:CD8+ T buněk, však u těchto jedinců chyběly. Zde je prokázána statisticky významná inverzní korelace mezi frekvencí CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 a poměrem CD4+:CD8+ T buněk u infikovaných jedinců, kteří dostávají HAART a u nichž byla plazmatická virémie po delší dobu potlačena pod hranici detekce. Mezi frekvencí HIV-1 specifických cytotoxických CD8+ T lymfocytů (CTL) a poměrem CD4+ :CD8+ T buněk u těchto jedinců nebyla zjištěna žádná korelace. Tyto údaje naznačují, že přetrvávající nízká úroveň probíhající virové replikace, která sice nestačí k udržení HIV-1 specifické odpovědi CTL, může částečně vysvětlovat, proč u některých infikovaných jedinců úspěšně léčených HAART nedochází k normalizaci poměru CD4+ :CD8+ T lymfocytů.

Používání vysoce aktivní antiretrovirové terapie (HAART) při léčbě osob infikovaných virem lidské imunodeficience typu 1 (HIV- 1) dramaticky změnilo klinické výsledky u mnoha infikovaných osob a vedlo k podstatnému snížení výskytu AIDS a úmrtnosti . U většiny infikovaných osob, u nichž viremie v plazmě klesla pod hranici detekce, však byla prokázána přítomnost viru schopného replikace , provirové DNA HIV-1 (včetně 2 dlouhých terminálních repetic ), sestřihané a nesestřihané RNA HIV-1 v buňkách CD4+ T a neidentifikovaných rezervoárů viru, a tyto zdroje pokračující replikace se staly hlavní překážkou bránící eradikaci HIV-1 .

Po zahájení HAART dochází u velké části infikovaných jedinců k rychlému poklesu plazmatické viremie pod hranici detekce a následnému postupnému zvyšování počtu CD4+ a snižování počtu CD8+ T lymfocytů. U některých infikovaných jedinců, kteří jinak úspěšně reagovali na HAART, však k normalizaci poměru CD4+:CD8+ T buněk nedochází . V této souvislosti se předpokládá, že chronicky zvýšené hladiny CD8+ T buněk nebo abnormální poměr CD4+:CD8+ T buněk v periferní krvi jsou způsobeny aktivní virovou replikací u infikovaných jedinců, kteří nejsou léčeni nebo dostávají suboptimální protivirovou léčbu . Kromě toho se ukázalo, že exprese aktivačního markeru CD38 na buňkách CD8+ T je prognostickým markerem progrese onemocnění . Ačkoli se předpokládá, že selhání normalizace poměru CD4+:CD8+ T buněk u některých pacientů užívajících HAART lze přičíst neúplnému potlačení virové replikace , nejsou k dispozici žádné údaje, které by se touto otázkou přímo zabývaly, zejména u pacientů, kteří užívají HAART delší dobu a u nichž byla dobře potlačena plazmatická virémie.

Bylo zjištěno, že rezervoár infikovaných CD4+ T buněk v periferní krvi, určený počtem buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1, je udržován probíhající virovou replikací, a to i při velmi nízkých hladinách . V této studii jsme hodnotili vztah mezi poměrem počtu buněk CD4+:CD8+ T a četností buněk CD4+ T nesoucích provirovou DNA HIV-1 v purifikovaných buňkách CD4+ T a četností HIV specifických cytotoxických lymfocytů CD8+ T (CTL) u infikovaných jedinců, kteří dlouhodobě užívali HAART a u nichž byla plazmatická virémie potlačena pod úroveň detekce stanovenou standardními testy.

Pacienti a metody

Izolace CD4+ T buněk. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly získány centrifugací na hustotním gradientu s ficollem. CD4+ T buňky byly izolovány z PBMC jedinců infikovaných HIV-1 pomocí techniky separace buněk na bázi kolon (Stem-Cell Technologies), jak je popsáno jinde .

Kvantitativní PCR HIV-1 DNA v reálném čase. Pro stanovení frekvence CD4+ T buněk nesoucích provirus HIV-1 u infikovaných jedinců byla provedena PCR v reálném čase, jak je popsáno níže. Genomová DNA byla izolována z 1-2 × 106 purifikovaných CD4+ T buněk pomocí soupravy pro izolaci DNA Puregene (Gentra) podle specifikací výrobce. DNA (1 µg) byla poté použita jako templát pro PCR v reálném čase v iCycleru (Bio-Rad). Amplifikační reakce byla provedena ve třech opakováních za použití 0,5 µM primerů, 0,2 µM fluorescenční sondy, 0,8 µM dNTPs, 5 µM MgCl2 a 2,5 U Platinum Taq Polymerase (Life Technologies) v celkovém objemu 50 ml. Byly použity primery 5′- GGTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′ primer) a 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′ primer) spolu s fluorescenční sondou 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTTAMRA- 3′. Podmínky PCR se skládaly z denaturace při 95 °C po dobu 3 min, následované 45 cykly po 15 s při 95 °C a 1 min při 58 °C. Sériově naředěná DNA ACH-2 byla rovněž podrobena výše uvedené PCR pro získání standardních křivek.

Průtoková cytometrická analýza HIV-1 specifických CD8+ T buněk. Četnost CD8+ T buněk specifických pro HIV-1 byla stanovena analýzou intracelulárních interferon (IFN)-γ pozitivních buněk po stimulaci HIV-1 specifickými peptidy (20 mer překrývajících 15 aa). Skupiny překrývajících se peptidů (po 1 µg; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) pokrývající celé sekvence HIV-1 gag, pol, env a nef byly nejprve inkubovány s 3 × 106 PBMC po dobu 10 min ve zkumavce s kulatým dnem o objemu 5 ml (Becton Dickinson) v 0,1 ml kompletního média v inkubátoru s 37 °C CO2. Poté bylo do zkumavky přidáno 0,4 ml kompletního média a po dvouhodinové inkubaci byl do média přidán Brefeldin A (Sigma) v konečné koncentraci 10 mg/ml k inhibici sekrece IFN-γ. Po 6 h inkubace byly buňky dvakrát promyty, fixovány fixačním roztokem 1× (Becton Dickinson) po dobu 10 min při pokojové teplotě a znovu promyty. Buňky byly permeabilizovány 1× permeabilizačním roztokem 2 (Becton Dickinson) a dále inkubovány 10 min při pokojové teplotě. Po opětovném promytí byly buňky obarveny následujícími protilátkami: protilátkou anti-CD8 konjugovanou s fluorescein-izothiokyanátem, protilátkou antiIFN-γ konjugovanou s fykoerythrinem, protilátkou anti-CD69 konjugovanou s peridinin-chlorofylovým proteinem a protilátkou anti-CD3 konjugovanou s alophycocyaninem (Becton Dickinson). S bránou na CD3+CD8+ lymfocyty bylo shromážděno ~100 000 událostí pomocí přístroje FACSCalibur (Becton Dickinson) a frekvence IFN-γ + CD69+ buněk byla stanovena pomocí softwaru Cellquest (Becton Dickinson).

Statistická analýza. Jako míra korelace mezi (1) četností CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 a počtem CD4+ a CD8+ T buněk a poměrem CD4+:CD8+ T buněk a (2) četností HIV-1- specifických CTL a počtem CD4+ a CD8+ T buněk, poměrem CD4+:CD8+ T buněk a počtem CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 byla použita Spearmanova ranková korelace. Fisherův přesný test byl použit ke stanovení souvislosti poměru CD4+:CD8+ T buněk ⩾1,0 nebo <1,0 s provirovou zátěží v kompartmentu CD4+ T buněk. Bonferroniho metoda pro úpravu hodnot P pro vícenásobné testování byla použita pro korelace počtu CD4+ a CD8+ T buněk a poměru CD4+:CD8+ T buněk s frekvencí CD4+ T buněk nesoucích provirální DNA HIV-1 a byla použita pro korelace počtu CD4+ a CD8+ T buněk, poměru CD4+:CD8+ T buněk a hladin provirální DNA HIV-1 v kompartmentu CD4+ T buněk s frekvencí HIV-1 specifických CTL.

Výsledky

Korelace mezi velikostí rezervoáru CD4+ T buněk HIV-1 a imunologickými parametry. Abychom prozkoumali vztah mezi velikostí rezervoáru CD4+ T buněk pro HIV-1 v periferní krvi a abnormálními periferními imunologickými parametry u infikovaných jedinců, kteří dlouhodobě úspěšně užívají HAART, snažili jsme se zjistit korelace mezi frekvencí CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 a počtem CD4+ a CD8+ T buněk a poměrem CD4+ :CD8+ T buněk. Byla zjištěna statisticky významná inverzní korelace mezi frekvencí CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 a počtem CD4+ T buněk v periferní krvi námi studovaných infikovaných osob (P = .02; obrázek 1A). Naproti tomu nebyla zjištěna žádná korelace mezi náloží HIV-1 provirové DNA v buňkách CD4+ T a počtem buněk CD8+ T (P = .34; obrázek 1B). Když byly tyto 2 imunologické parametry zkombinovány a vyjádřeny jako poměr CD4+:CD8+ T buněk, byla pozorována silná inverzní korelace mezi těmito hodnotami a četností CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 (P .01; obrázek 1C). Navíc 14 (74 %) z 19 pacientů s poměrem CD4+:CD8+ T buněk ,1,0 mělo provirální nálož HIV-1 DNA <1000 kopií/µg genomové DNA získané z CD4+ T buněk. Naopak 10 (77 %) z 13 pacientů s poměrem CD4+:CD8+ T buněk >1,0 mělo provirovou nálož HIV DNA ,1000 kopií/mµg genomové DNA pocházející z CD4+ T buněk (P = ,01; obrázek 1C).

Korelace mezi frekvencí HIV-1 specifických CTL a imunologickými a virologickými parametry. Bylo prokázáno, že frekvence HIV-1 specifických CTL po zahájení HAART u osob infikovaných HIV-1 postupně klesá v důsledku snižující se dostupnosti antigenů HIV-1 . Zkoumali jsme vztah mezi frekvencí HIV-1 specifických CTL a poměrem CD4+:CD8+ T buněk u infikovaných jedinců, kteří úspěšně odpovídali na HAART po delší dobu. Nebyla zjištěna žádná statisticky významná korelace mezi frekvencí CTL, které reagovaly na HIV specifické peptidy odvozené od genů gag, pol, env a nef, a poměrem CD4+:CD8+ T buněk (obrázek 2). Kromě toho nebyla zjištěna žádná statisticky významná korelace mezi počtem CTL specifických pro HIV-1 a počtem CD4+ a CD8+ T buněk a počtem CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 (údaje nejsou uvedeny). Za zmínku stojí trend k vyššímu počtu CTL u jedinců s nižším poměrem CD4+:CD8+ T buněk.

Diskuse

Široké používání HAART při léčbě onemocnění HIV-1 vedlo k dramatickému zlepšení klinických výsledků . Ačkoli u mnoha infikovaných osob užívajících HAART lze udržet plazmatickou viremii pod hranicí detekce, přetrvávání nízkých hladin probíhající virové replikace v buňkách CD4+ T představuje hlavní překážku v dosažení eradikace HIV-1 . Přetrvávající nízká úroveň virové replikace je totiž považována za hlavní faktor podílející se na udržování rezervoáru HIV-1, což se odráží v četnosti buněk CD4+ T nesoucích provirovou DNA HIV-1 u pacientů, jejichž plazmatická viremie byla pomocí HAART potlačena pod úroveň detekce standardních testů . Kromě toho byly u vysokého podílu infikovaných pacientů užívajících HAART pozorovány trvale zvýšené počty CD8+ T buněk . V této souvislosti se předpokládá, že za zvýšené hladiny CD8+ T buněk je zodpovědná aktivní virová replikace a že úroveň exprese aktivačního markeru CD38 na těchto buňkách se ukázala být prognostickým markerem progrese onemocnění při absenci účinné protivirové léčby .

Přes nedostatek publikovaných údajů se spekuluje, že inverzní poměr CD4+:CD8+ T buněk v periferní krvi infikovaných osob, které jsou úspěšně léčeny HAART, je způsoben nízkou hladinou probíhající virové replikace . V této studii jsme zkoumali, zda jsou inverzní poměry CD4+:CD8+ T buněk u některých infikovaných jedinců, kteří dlouhodobě užívají HAART, způsobeny neúplnou supresí replikace HIV-1, což se projevuje velikostí rezervoáru provirové DNA HIV-1 v buňkách CD4+ T . Přetrvávající přítomnost provirové DNA HIV-1 v kompartmentu buněk CD4+ T u infikovaných pacientů užívajících HAART byla přesvědčivě popsána jinde a předpokládalo se, že odráží neúplnou inhibici zbytkové probíhající virové replikace, a to i přes potlačení plazmatické virémie na nedetekovatelnou úroveň . Prokázali jsme silnou inverzní korelaci mezi frekvencí infikovaných CD4+ T buněk obsahujících provirovou DNA HIV-1 a poměrem CD4+ a CD8+ T buněk, což naznačuje, že nízká úroveň reziduální virové replikace mohla být částečně zodpovědná za abnormální poměr CD4+:CD8+ T buněk v periferní krvi.

Ačkoli frekvence CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 může přímo souviset s poměrem CD4+:CD8+ T buněk, tento vztah mohou ovlivňovat i další faktory. Parametry, jako je existence neznámých rezervoárů viru, které podporují aktivní replikaci viru v přítomnosti HAART, abnormality v imunitním systému hostitele, účinnost daných léčebných režimů nebo jiné matoucí faktory, mohou mít vliv jak na CD4+: CD8+ T-lymfocyty a provirovouDNA v kompartmentu CD4+ T-lymfocytů. Naše údaje naznačují, že probíhající replikace viru na úrovních, které nejsou detekovatelné standardními testy plazmatické viremie, ale které udržují rezervoár HIV-1 v buňkách CD4+ T, ačkoli jsou dostatečné k tomu, aby bránily normalizaci CD4+: CD8+ T buněk u pacientů zkoumaných v této studii, nestačí k udržení HIV-1 specifických CTL odpovědí.

Možno tvrdit, že trvalé abnormální poměry CD4+:CD8+ T buněk u infikovaných jedinců užívajících HAART po delší dobu lze také přičíst jak imunologickým, tak virologickým faktorům. V tomto ohledu bylo prokázáno, že při absenci progrese onemocnění a dostatečné obnovy CD4+ T buněk je celková homeostáza T buněk u infikovaných jedinců udržována zvýšenými hladinami CD8+ T buněk, které mohou naopak bránit regeneraci CD4+ T buněk . Nezjistili jsme však korelaci mezi hladinami CD4+ T buněk nesoucích provirovou DNA HIV-1 a počtem CD8+ T buněk.

Nakonec předchozí studie ukázaly, že tvorba CD4+ T buněk v brzlíku je vážně omezena buď přímými, nebo nepřímými důsledky aktivní virové replikace . V tomto ohledu byla u infikovaných jedinců prokázána snížená úroveň produkce thymu, měřená četností naivních CD4+ T buněk nesoucích vylučovací kruhy T buněčného receptoru . Ačkoli není jasné, zda jsou prekurzory buněk CD4+ T infikovány HIV-1 v thymu, naše údaje silně naznačují, že neúplné potlačení virové replikace u infikovaných jedinců užívajících HAART pokračuje v šíření infekce v kompartmentu buněk CD4+ T v periferní krvi, což vede k udržování rezervoáru buněk CD4+ T pro HIV-1 .

Poděkování

Děkujeme Paulu Parksovi za naplánování návštěv pacientů, Susan Moirové za přečtení tohoto rukopisu a za užitečné diskuse a pacientům za jejich účast v této studii.