Struktura roztoku, glykanové specifity a inhibiční aktivity fenoloxidázy lektinů typu C Anopheles CTL4 a CTLMA2

Zachování CTL4/CTLMA2 u Anopheles

CTL4 i CTLMA2 se skládají ze signálního peptidu, krátké N-koncové sekvence obsahující motiv CXCXC a jedné domény CTL. Nedávná zpráva naznačuje, že funkce CTL4 a CTLMA2 nebo jejich kofaktorů se v rámci rodu Anopheles rozdělila, a konkrétně že CTL4 rodu An. albimanus neobsahuje N-koncové zbytky cysteinu, které se podílejí na disulfidových vazbách22. Nejprve jsme znovu prozkoumali ortology CTL4 (AGAP005335) a CTLMA2 (AGAP005334), které mají blízkou orientaci zády k sobě na chromozomu 2L (obr. 1a), pomocí aktuálních genových modelů (k únoru 2019) ve Vectorbase24. Proteiny s N-koncovým motivem CXCXC jsme našli u 15/16 ortologů CTL4, včetně ortologa An. albimanus AALB014534, a 13/14 ortologů CTLMA2. Provedli jsme vícenásobné zarovnání sekvencí CTL4 i CTLMA2 z 10 asijských, afrických a novosvětských druhů Anopheles (obr. 1b). Nezakořeněné fylogenetické stromy mají téměř identickou topologii a kombinovaný fylogenetický strom má dvě symetrické větve, s výjimkou pozice An. dirus vůči An. funestus a An. maculatus.

To podporuje hypotézu, že CTL4 a CTLMA2 jsou v rámci rodu Anopheles zachovány, přičemž chybějící ortologové odrážejí neúplnou anotaci některých genomů. Prozkoumali jsme genomovou oblast tří druhů, u kterých byl zaznamenán ortolog CTL4, ale nebyl zaznamenán ortolog CTLMA2: stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 a An. melas AMEC014491. Všechny mají blízký nebo překrývající se gen v inverzní orientaci – ASTE002636, AMIN007379 a AMEC088499, zahrnující dvě CTL domény. U An. stephensi a An. minimus předchází druhé CTL motiv CXCXC, což naznačuje, že se může jednat o ortology CTLMA2. U komárů rodu Aedes a Culex je situace méně jasná. U Ae. albopictus je anotován ortolog CTLMA2 včetně N-koncového motivu CXCXC, AALF001196, a má blízko k sobě obrácený dvouexonový gen AALF001195, který se skládá ze serinové proteázy a CTL domény. Model genu pro Ae. aegypti z října 2018 zahrnuje ortolog CTLMA2 s N-koncovým CXCXC motivem, CTLMA14 (AAEL014382), v současnosti uvedený jako ortolog CTL4). U C. quinquefasciatus je anotován ortolog CTLMA2 (CPIJ000443), který však postrádá N-terminální motiv CXCXC. To naznačuje, že CTLMA2 vznikla u společného předka Anopheles a Aedes, zatímco CTL4 může být specifická pro Anopheles.

Biochemická charakterizace

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Obr. 1). 2a,b), CTL4 a CTLMA2 CRD (obr. S1a) a An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, obr. S1b) byly exprimovány v hmyzích buňkách pomocí expresního vektorového systému baculoviru (BEVS) a přečištěny do homogenity. Zralá AgCTL4 (25-177) má molární hmotnost 17,3 kDa a pI 7,7. Zralý AgCTLMA2 (18-174) má molární hmotnost 17,9 kDa a pI 4,5. Purifikovaný heterodimer má na neredukující (NR) SDS-PAGE molekulovou hmotnost 35 kDa (obr. 2a) a na velikostně vylučovací chromatografii (SEC) eluuje jako jediný pík se zdánlivou molekulovou hmotností 40 kDa (obr. 2b). Monomerní CTL4 a CTLMA2 se na redukující SDS-PAGE objevují při 17 kDa, resp. 20 kDa. Jak již bylo uvedeno dříve, zvýšená zdánlivá molekulová hmotnost CTLMA2 může odrážet jeho neobvyklé (kyselé) rozložení aminokyselin20.

Bylo prokázáno, že An. gambiae CTL4/CTLMA2 je stabilizován mezimolekulárním disulfidem mezi cysteiny N-koncového motivu CXCXC; mutace těchto tří cysteinů na alanin ruší tvorbu meziřetězcového disulfidu20. Abychom dále upřesnili umístění meziřetězcového disulfidu, zkonstruovali jsme devět mutantů obsahujících jediný cystein v N-koncovém motivu CXCXC CTL4 a CTLMA2, koexprimovali tyto proteiny v buňkách Sf9 a provedli Western Blotting k detekci CTL4 a CTLMA2. Tvorba intermolekulárních disulfidů byla ve všech případech neúčinná, ale zjevná na neredukující SDS-PAGE (obr. 2c).

To naznačuje, že tvorba N-terminálních intermolekulárních disulfidů mezi CTL4 a CTLMA2 je spíše promiskuitní, než že by zahrnovala konkrétní cysteinový zbytek z každého proteinu. Pokud je tvorba intermolekulárních disulfidů promiskuitní, mohly by heterodimery CTL4/CTLMA2 v zásadě tvořit multivalentní disulfidicky vázané oligomery. U CTL4/CTLMA2 An. gambiae však nebyly na NR-SDS-PAGE zjištěny žádné disulfidicky vázané oligomery (obr. 2a). Podobně, zatímco CTL4 a CTLMA2 mohou in vitro tvořit disulfidicky propojené homodimery20 , purifikovaný produkt je v drtivé většině (>95 %) heterodimer. U CTL4/CTLMA2 An. albimanus (obr. S1b) jsou na NR-SDS-PAGE pozorovány některé menší pásy (~10 %), které mohou představovat tvorbu homodimerů nebo oligomerů.

Jak An. gambiae CTL4/CTLMA2, tak An. albimanus CTL4/CTLMA2 jsou v roztoku polydisperzní. Nekovalentní oligomerizace vyššího řádu je patrná jako rameno hlavního píku v SEC s rostoucí koncentrací a je výraznější u An. albimanus CTL4/CTLMA2 (obr. S1). Existenci oligomerních druhů jsme potvrdili pomocí sedimentačně-rychlostní analytické ultracentrifugace (AUC) (obr. 2d). Při pH 7,5 je v distribuci c(s) pozorována řada druhů s klesající intenzitou: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomerizace je nezávislá na Ca2+ u A. gambiae CTL4/CTLMA2, ale výrazně se zvyšuje s Ca2+ u A. albimanus CTL4/CTLMA2 (obr. S1b) a podle dynamického rozptylu světla (DLS) nekoreluje s pH (obr. 2e).

Vazba vápníku

Jako CTL mohou CTL4 i CTLMA2 vázat vápník. Kanonické zbytky vázající Ca2+ jsou však u CTL4 mutovány, což naznačuje, že se může jednat o CTLD, ale nikoliv o CRD typu C. Proto jsme měřili afinitu k vazbě vápníku CTL4, CTLMA2 a heterodimeru CTL4/CTLMA2 An. gambiae a An. albimanus pomocí izotermické titrační kalorimetrie (ITC). Za stejných podmínek byla pozorována vazba pro CTLMA2 a CTL4/CTLMA2, ale ne pro CTL4 (obr. 3a-c). Vazebné konstanty a termodynamické parametry byly vypočteny z výsledků tří nezávislých experimentů (tab. 1). Vazba CTLMA2 na Ca2+ dobře odpovídá modelu jednoho místa s KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. Afinita CTL4/CTLMA2 An. gambiae k vápníku je ~40× vyšší než CTLMA2 s KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (obr. 3d) má podobnou afinitu k vápníku s KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Vazba vápníku na An. gambiae i An. albimanus CTL4/CTLMA2 však byla substechiometrická (N = 0,36-0,50).

Vazba na glykany

CTL4 a CTLMA2 patří do linie myeloidních CTL – včetně makrofágového manózového receptoru (MMR) a DC-SIGN -, které tvoří konzervovanou rodinu imunitních receptorů u metazoí15,25 . Mezi CTL se známou strukturou má CTLMA2 30% sekvenční identitu s doménou rozpoznávající karbohydráty (CRD) myšího scavengerového receptoru (SCRL, PDB ID 2OX9)26 a prasečího surfaktantového proteinu D (SP-D, PDB ID 4DN8)27 . CTLMA2 zachovává zbytky spojené s vazbou Ca2+ v glykanové vazebné smyčce a kanonický motiv EPN spojený se selektivitou D-manosy (obr. 4a). Naproti tomu CTL4 postrádá všechna rezidua spojená s vazbou Ca2+, což je v souladu se skutečností, že pomocí ITC nebyla pozorována žádná vazba. Jediným CTL známé struktury se značnou podobností s CTL4 je protein vázající faktor IX/X (X-bp) z jedu čínského mokasína Deinagkistrodon acutus (1IOD). X-bp je modifikovaný CTLD, v němž je glykanová vazebná doména nahrazena dlouhou smyčkou, která zprostředkovává dimerizaci za účelem vytvoření vazebného místa pro faktor IX/X. Ačkoli tedy některé hmyzí CTL nevyžadují pro vazbu glykanů vápník, není jasné, zda by CTL4 vůbec měla glykany vázat.

Abychom definovali jejich lektinovou aktivitu, analyzovali jsme CTL4, CTLMA2 a heterodimer CTL4/CTLMA2 na glykanových polích, která zobrazují 367 jedinečných glykanových struktur28. Tyto studie prokázaly vazbu na celou řadu glykanů (tab. 2). Monomery CTL4 a CTLMA2 prokázaly vazbu pouze na čtyři, resp. šest glykanů, zatímco heterodimer vázal 18 různých glykanů. Mezi ligandy vázanými jednotlivými monomery a heterodimerem je znatelný rozdíl; 3/4 (75 %) glykanů rozpoznaných CTL4 a 2/6 (33 %) glykanů rozpoznaných CTLMA2 nebyly rozpoznány CTL4/CTLMA2.

Pro potvrzení výsledků glykanového pole a určení vazebných preferencí CTL byla provedena analýza SPR (tabulka 3). Téměř ve všech interakcích se glykanové pole a SPR shodovaly v přítomnosti interakcí, přičemž SPR naznačila, že glykanové pole mělo čtyři falešně negativní výsledky: CTLMA2 monomer s H-antigenem, chondroitin sulfátem a chondroitin-6-sulfátem a CTL4 monomer s chondroitin-6-sulfátem. Všechny falešně negativní výsledky však ukázaly vazbu na matrici s heterodimerem CTL4/CTLMA2.

CTL nerozpoznaly glykany obsahující manózu, s výjimkou manóza-6-fosfátu u CTL4/CTLMA2, navzdory kanonickému motivu EPN přítomnému u CTLMA2. Rozpoznávané struktury jsou spíše obecně glykosaminoglykanové (GAG) motivy zahrnující β1-3/β1-4 vazby mezi glukosou (Glc), galaktosou (Gal) a jejich příslušnými hexosaminy GlcNac a GalNac. Vazba Galβ1-4Glc byla přítomna u 12/23 (52 %) rozpoznaných glykanů, včetně 6/23 (26 %) obsahujících Galβ1-4GlcNac a 4/23 (17 %) obsahujících keratanový motiv Galβ1-4GlcNac β1-3Gal nebo GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

Mřížka také vykazovala určitou preferenci pro polymerní a sulfátové glykany. Ze čtyř glykanů rozpoznávaných CTL4 byl nejsilnější zásah pro globopentaosu (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 také vázal HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n a β1-3Glukan (Glcβ1-4Glc)n. Tři z pěti glykanů rozpoznávaných monomerem CTLMA2 byly sulfátové a heterodimer CTL4/CTLMA2 rozpoznával chondroitin sulfát a chondroitin-6 sulfát, kyselinu hyaluronovou (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 a HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Tyto výsledky naznačují, že existují odlišné a synergické účinky heterodimerizace na vazbu glykanů.

CTLMA2 i heterodimer CTL4/CTLMA2 rozpoznávají několik cukrů obsahujících fukózu, včetně sialylu-LewisX a sulfo-LewisA, ale ne sialyl-LewisA. Nejvyšší afinita vazby byla pozorována k sulfo-LewisA s vazbou na komplex CTLMA2 (106 nM) a CTL4/CTLMA2 (95 nM) při KD ~100 nM (tab. 3). Nejvyšší afinita pozorovaná u CTL4 byla rovněž k sulfátovanému glykanu, sulfo-laktosaminu (292 nM).

Strukturní analýza

Pro další zkoumání struktury CTL4 a CTLMA2 jsme vytvořili strukturní modely CTL4 a CTLMA2 (obr. 4b) pomocí programu MODELLER29 s dalšími ručními úpravami. CTL4 i CTLMA2 mají prodlouženou smyčku (smyčka 1) následující po druhé šroubovici CTLD (obr. 4a) s vysokou hustotou komplementárně nabitých zbytků; bazických zbytků u CTL4 a kyselých zbytků u CTLMA2. Komplementární elektrostatické vlastnosti těchto zbytků smyčky 1 a jejich blízkost k N-koncovému motivu CXCXC naznačují, že se jedná o potenciální rozhraní protein/protein v rámci heterodimeru (obr. 4b), pro který byl vytvořen hypotetický model s jedinou disulfidovou vazbou v motivu CXCXC. Druhým potenciálním rozhraním jsou však glykanové/Ca2+ vazebné smyčky, jak bylo pozorováno u dvou řetězců D. acutus X-bp. Alternativní hypotéza předpokládá, že obě domény CTL jsou na sobě nezávislé a spojují je flexibilní vazby prostřednictvím mezimolekulární hypotézy.

Pro ověření této hypotézy jsme analyzovali strukturu roztoku CTL4/CTLMA2 pomocí rozptylu rentgenového záření pod malým úhlem (SAXS). Experimenty byly prováděny v 0,5 M NaCl, 20 mM CHES pH 9,0, 0,5 mM CaCl2 a 1 % glycerolu, aby se minimalizovaly interakce mezi částicemi. Za těchto podmínek vykazoval protein lineární závislost mezi extrapolovanou intenzitou při nulovém úhlu a koncentrací (I0 vs. c) až do koncentrace 3,1 mg/ml. Křivka intenzity I vs. q odečtená z pufru (obr. 4c) byla podrobena programu SAXSMoW2 , který poskytuje RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) a molekulovou hmotnost MW = 39 kDa, což je pouze o 11 % více než očekávaná MW heterodimeru 35 kDa30. Vypočítaný Guinierův graf je však založen pouze na sedmi datových bodech; fitování v rozšířeném rozsahu (obr. 4c, vložka) dává RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), zatímco fitování párové distribuční funkce P(r) (obr. 4d) dává RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). Distribuční funkce P(r) fitovaná pomocí DAMMIF31 s 20 ab initio modely kuliček s průměrnou normalizovanou strukturní diskrepancí NSD = 1,0 ± 0,2. Hlavní tělo ab initio modelů má podobný tvar jako očekávaný heterodimer CTL4/CTLMA2.

Z hlavního těla korálkových modelů vystupuje další hustota, která může odrážet buď N-terminální sekvenci obou proteinů včetně motivu CXCXC, nebo menší populaci CTL4/CTLMA2 s vyšším poloměrem gyrace. K ověření této hypotézy jsme provedli vícestavové modelování profilu SAXS pomocí programu MULTIFOXS32. Vytvořili jsme kompletní model pro CTL4-6xHis/CTLMA2 s N-koncovou spirálou zakončenou mezimolekulárním disulfidem mezi CTL4 C39 a CTLMA2 C34. MULTIFOXS vygeneroval soubor 10 000 variant modelu pro porovnání s experimentální křivkou rozptylu. Jedinými flexibilními zbytky byly CTL4 40-45 a 178-183 (6xHis) a CTLMA2 35-39, přičemž N-koncová spirála sloužila jako tuhé těleso spojující oba řetězce. Nejlepší jednostavový model odpovídal datům s χ2 = 1,13 a měl RG = 23,7 Å. Minimální χ2 = 1,07 bylo dosaženo s třístavovým modelem (obr. 4e), ve kterém se na rozptylu z 80 % podílejí dva kompaktní modely s RG = 22,0 Å A RG = 23,7 Å. Tato data jsou v souladu s tvorbou kompaktního heterodimeru mezi CTL4 a CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 inhibují aktivaci fenoloxidázy v reakci na E. coli

CTL4 a CTLMA2 fungují jako inhibitory melanizační reakce komárů na infekci. Již dříve bylo uvedeno, že vyřazení CTL4 nevedlo ke zvýšení aktivity fenoloxidázy (PO) v reakci na infekci směsí E. coli a S. aureus20. Stejná studie však zjistila, že komáři dsCTL4 a dsCTLMA2 byli specificky citliví na gramnegativní bakterie. Proto jsme znovu zkoumali vliv vyřazení CTL4 a CTLMA2 na aktivitu PO v hemolymfě v reakci pouze na infekci E. coli (obr. 5a). Po 4 hodinách po infekci E. coli byla aktivita PO u komárů dsCTL4 (p = 0,02) a dsCTLMA2 (p = 0,004) ve srovnání s kontrolním vzorkem dsLacZ významně zvýšena (obr. 5b). Průměrná účinnost knockdownu pro CTL4 byla 93 ± 3 % a pro CTLMA2 89 ± 3 %, přičemž >80 % v každém jednotlivém experimentu.

Melanizace ookinet Plasmodium po umlčení CTL4/CTLMA2 je závislá na LRIM117,22, TEP133 a SPCLIP133. Protože všechny tyto prvky jsou součástí imunitní odpovědi podobné komplementu TEP1, usoudili jsme, že zvýšená aktivita PO v nepřítomnosti CTL4 by měla být závislá na TEP1. V souladu s tím jsme porovnali zvýšení aktivity PO u komárů dsCTL4 při současném podávání dsTEP1 se současným podáváním dsLacZ (obr. 5c). Průměrná účinnost knockdownu pro TEP1 byla 82 ± 9 % a >80 % v 5/6 experimentech (64 % v jednom experimentu). Ve skutečnosti nedošlo k žádnému významnému zvýšení aktivity PO u komárů dsCTL4, když byl umlčen také TEP1. To potvrzuje, že melanizace v nepřítomnosti CTL4/CTLMA2 je závislá na TEP1.

Současné podání rekombinantního CTL4/CTLMA2 s E. coli významně zvrátilo zvýšení aktivity PO u dsCTL4 komárů ve srovnání s BSA (p = 0,007, obr. 5d). Tyto výsledky ukazují, že CTL4/CTLMA2 se přímo podílí jako negativní regulátor aktivity PO. U dsLacZ komárů však CTL4/CTLMA2 nepotlačoval aktivitu PO vyvolanou E. coli ve srovnání s bovinním sérovým albuminem (BSA). Rovněž aktivita PO vyvolaná E. coli u komárů dsCTL4, kterým byl současně aplikován rekombinantní CTL4/CTLMA2 (dsCTL4 + CTL), byla vyšší než u komárů dsLacZ, kterým byl současně aplikován BSA (dsLacZ + BSA). Injekce rekombinantního CTL4/CTLMA2 tedy zcela nezachraňuje ztrátu endogenního proteinu

.