1. června 2016 (Roč. 36, č. 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Zakladatelka a hlavní autorka DeeAnn Visk Consulting
Genová terapie musí prolomit buněčné valy, aniž by si zopakovala pád Jericha v miniatuře
Imunoterapie proti rakovině, vakcíny proti novým virům (nebo starým virům na nových místech) a pokusy o řešení patogenních defektů jedné buňky – to vše se snaží zahrnout transfekční technologie. Tato technologie, která zahrnuje různé způsoby vnášení nukleových kyselin do buněk, je velmi slibná, ale představuje také vážné problémy.
Tyto problémy se nejvíce projevily při pokusech o zavedení genové terapie, která má potíže s řešením problému obtížně transfekovatelných buněk, orgánů a celých zvířat.
Těchto problémů s transfekcí se ujalo několik biotechnologických společností. Například společnosti MaxCyte, Lonza a Mirus Bio nabízejí elektroporaci jako metodu, která po sobě zanechává jen malé zbytky. Stává se, že elektroporace není vhodná pro použití u všech zvířat, takže je zapotřebí jiných metod. Jednou z alternativních technik je virová infekce. Využívají ji společnosti jako GenVec.
Dalším problémem, který se týká zejména virové transfekce, je možnost stimulace imunitní reakce. Toto potenciální negativum však může být skutečným pozitivem ve správném kontextu, kterým je shodou okolností vývoj vakcíny. Využití přístupů virové transfekce k posílení vakcinačních mechanismů je specialitou společnosti Thermo Fisher Scientific. Tato společnost nabízí také tradiční transfekci na chemické bázi, která funguje na celém zvířeti.
Společně tedy dosud zmíněné společnosti nabízejí technologie, které pokrývají všechny hlavní způsoby terapeuticky relevantní transfekce: transfekci na chemické bázi, nechemické metody (především elektroporaci) a virovou transdukci. Vyvíjejí se také hybridní přístupy, jak bude zřejmé z následujících částí.
Elektroporace
Elektroporační platforma společnosti MaxCyte je v souladu s GMP a je bezproblémově škálovatelná z výzkumného do komerčního měřítka. „Náš průtokový elektroporační systém umožňuje transfekci milionu až několika set miliard buněk za méně než 30 minut v plně automatizovaném uzavřeném systému,“ vysvětluje Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. „Náš systém je v souladu s normami ISO 9000 i FDA, takže se snadno přizpůsobí potřebám výroby na terapeutické úrovni.“
„Běžně spolupracujeme s farmaceutickými a biotechnologickými společnostmi na vývoji ex vivo upravených imunitních a kmenových buněčných terapií. Někdy je cílem rychlá výroba vakcín a biologických léčiv s vysokou výtěžností, například protilátek. Jindy umožňujeme zákazníkům vytvořit rozsáhlou produkci virových vektorů ve vysokém titru pomocí suspenzních a adherentních buněk. To pomáhá nejen při vývoji léčebných přípravků, ale může to také urychlit aplikace při objevování léčiv.“
Tato schopnost zpracovávat buňky ve velkém nebo malém počtu umožňuje vědcům u stolu vyvinout procesní protokol s použitím průtokové elektroporace pro malé počty buněk. Zvětšování tohoto procesu je pak bezproblémové bez obvyklých starostí s udržením kvality, protože proces transfekce zůstává stejný.
„Toto snížení rizika je pro naše partnery velmi atraktivní. Zajištění konzistence od výzkumu, přes kliniku až po komerční měřítko a od série ke sérii, od dárce k dárci a od pacienta k pacientovi je rozhodující pro efektivní průchod terapií procesem vývoje,“ tvrdí Dr. Peshwa.
Zatímco chemické a lipidové přístupy fungují dobře ve výzkumu se zavedenými buněčnými liniemi, transfekce primárních buněk má často neočekávané důsledky. Navíc je obtížné tyto tradiční chemické způsoby transfekce buněk rozšířit na průmyslovou výrobu.
Elektroporace, nevirový přístup používaný společností MaxCyte, umožňuje zachovat biologii transfekovaných buněk v přirozenějším stavu v jakémkoli měřítku. Tím, že technologie společnosti MaxCyte zabraňuje vzniku nezamýšlených následků během procesu transfekce, může zabránit vzniku překážek a zároveň řeší potřebu vysoké účinnosti transfekce.
„U těchto terapeutických zásahů musí být prakticky zaručeno, že budou mít minimální nezamýšlený negativní dopad na modifikované buňky – veškerá biologie musí být v každé fázi procesu stejná,“ trvá na svém Dr. Peshwa. „Náš průtokový elektroporační systém lze navíc používat automatizovaně. V Japonsku se již rutinně používá pro komerční terapeutickou léčbu a je v různých fázích zavádění po celém světě.“
Dalším aspektem je místo, kde transfekce probíhá. Jsou buňky odebrané pacientovi převezeny ke zpracování do jiného města? Co se stane, když se zásilka ztratí, zpozdí nebo dojde k výkyvům teploty? Platforma nabízená společností MaxCyte nabízí možnost vyvíjet nové terapie prostřednictvím zpracování buněk pacientů přímo na místě, čímž se obejdou hlavní problémy s logistikou a náklady na prodané zboží (COGS) u jiných metod.
Vývoj buněk je pro vývoj buněčných terapií zásadní. Elektroporační systém společnosti MaxCyte dokáže zabránit nechtěné modifikaci buněčného fenotypu a zároveň podle společnosti splňuje klíčové potřeby výzev buněčného inženýrství: účinnost, konzistenci, přenositelnost a škálovatelnost.
Virální transdukce
Virální vektory jsou obzvláště užitečné pro tranfekci celých zvířat nebo pro použití s tkáněmi, které mohou být obtížně dosažitelné pomocí chemických nebo elektroporačních přístupů. Společnost GenVec se specializuje na používání virových vektorů, konkrétně adenoviru, k dodávání genů pro terapeutické účely.
„Na první pohled se problémy spojené s imunitní reakcí na virové vektory zdají být problematické,“ vysvětluje Doug Brough, Ph. „Zjistili jsme však, že toho lze využít ke stimulaci imunitní reakce na cizí materiály, takže adenoviry by mohly být využity k dodávání vakcín.“
Společnost GenVec adenoviry důkladně prostudovala a vytvořila několik různých „příchutí“ adenovirů. Při zkoumání adenovirů u jiných druhů, jako jsou gorily a opice, mohou výzkumníci použít vektory, které jsou navrženy tak, aby se vyhnuly již existující imunitě, kterou má běžná lidská populace vůči adenovirům.
„Rozsáhlá knihovna vektorů nabízených společností GenVec se nazývá Adenoverse™,“ informuje Dr. Brough. „Vymazali jsme velké části adenovirů, abychom omezili vrozenou toxicitu spojenou s léčbou adenoviry. Kromě toho, že jsme zabránili škodlivé imunitní reakci na vektor, nám to umožňuje vměstnat do viru až 12 kb.“
S využitím různých přístupů spolupracuje GenVec s řadou společností na různých aplikacích, terapiích nukleovými kyselinami a technologiích úpravy genů. Modifikované adenoviry mohou poskytovat přístupy se zinkovým prstem, a to jak in vitro, tak in vivo.
Příklad jedné takové spolupráce lze nalézt u klinické studie společnosti Novartis zaměřené na regeneraci smyslových buněk do vnitřního ucha. „Infikováním buněk vnitřního ucha genem kódujícím klíčový regulační protein lze vytvořit nové mechanosenzorické buňky, které nahradí buňky ztracené v důsledku zranění nebo vrozených genetických podmínek,“ vysvětluje Dr. Brough.
Další společné projekty lze nalézt u partnerství v subjektech zabývajících se léčbou rakoviny a vývojem vakcín. „Když přijde čas na komercializaci technologie, GenVec použije buněčnou linii, která byla pro tyto aplikace již dříve schválena FDA,“ upřesňuje Dr. Brough.
„Další zřejmou výhodou použití adenovirů je, že mohou snadno transfekovat celá zvířata. Například ničivé onemocnění hospodářských zvířat, zvané slintavka a kulhavka, je přenášeno různými virotypy. Náš systém by mohl umožnit rychlou výměnu jakéhokoli kmene, který způsobuje epidemii, a umožnit rychlé dodání vakcíny na míru,“ popisuje Dr. Brough.
Nukleofekce
Lonza nabízí pokročilou formu elektroporace nazvanou Nucleofection™, která využívá roztoky pro transfekci specifické pro daný buněčný typ ve spojení s vyladěnějším systémem pulzního doručování, který umožňuje transfekci mnoha různých typů buněk, zejména normálních primárních lidských buněk.
„Namísto standardních roztoků elektroporačního pufru používáme roztoky pro transfekci specifické pro daný buněčný typ,“ říká doktor Gregory Alberts, Alberts, globální odborník na danou problematiku ve společnosti Lonza. „To nám umožňuje stabilizovat póry, které vznikají při dodávání pulzů. Předpokládáme, že póry vytvořené v buněčné membráně během standardní elektroporace se rychle uzavřou. Naše technologie stabilizuje póry vytvořené elektroporací a umožňuje materiálu difundovat do buňky, konkrétně do buněčného jádra.“
Přístup nukleofekce využívá mnoho různých substrátů: DNA, mRNA, siRNA, peptidy, proteiny a malé molekuly. Účinnost transfekce siRNA a mRNA je velmi dobrá, lepší než 90 %. Malé peptidy obvykle transfekují s účinností kolem 80 % a účinnost pro plazmidovou DNA se pohybuje od 50 % do 90 % v závislosti na typu buňky. Dokonce i velké substráty, větší proteiny, jako jsou protilátky nebo bakteriální umělé chromozomy (BAC), se mohou dostat do cílových buněk s poměrně účinnou účinností transfekce.
„Nukleofekce je překvapivě flexibilní,“ prohlašuje Dr. Alberts. „Byla použita k transfekci všech druhů primárních lidských buněk. Byla použita při generování iPSC (indukovaných pluripotentních kmenových buněk), transfekci CRISPR a dalších substrátů pro editaci genomu, stejně jako při transfekci exotičtějších cílů, jako je rodina parazitů Plasmodium, kteří způsobují malárii. Pomocí Nucleofection lze transfekovat i další podobné organismy a umožnit tak výzkum tropických nemocí.“
Platforma Nucleofection je škálovatelná. Vysoce výkonný systém Nucleofection například zvládá 96jamkové a 384jamkové formáty. Tento systém bude často využíván v základním screeningovém zařízení. Vědci na pracovišti mohou k optimalizaci podmínek testů použít 4D Nucleofector s nižší propustností. Vzhledem k tomu, že stolní zařízení 4D Nucleofector používá stejné podmínky transfekce, pracuje se stejným počtem buněk a poskytuje stejný výkon jako zařízení s vyšší propustností, není v případě přechodu na větší rozsah nutné test znovu optimalizovat.
„Kontinuita systému umožňuje srovnávání jablek s jablky při zvyšování nebo snižování rozsahu projektu,“ ilustruje Dr. Alberts.
„Právě probíhá beta testování nového velkoobjemového transfekčního zařízení, které bude schopno transfekovat 200 milionů až 1 miliardu buněk ve formátu od 1 do 20 ml. Předběžné výsledky ukazují, že zařízení transfekuje primární lidské buňky nebo buněčné linie na stejné úrovni jako ostatní zařízení Lonza Nucleofector,“ pokračuje Dr. Alberts. „Tento produkt bude uvolněn pouze pro výzkumné účely, i když vzhledem k tomu, že Nucleofection dokáže tak dobře transfekovat primární lidské buňky, bude nepochybně zájem o použití tohoto zařízení v kliničtěji zaměřených aplikacích.“
Dr. Alberts předpokládá, že Nucleofection by mohla hrát roli v inovativních a personalizovaných terapiích rakoviny, jako je terapie chimérickými antigenními T-buňkami (CAR-T), a také v dalších buněčných terapiích vyžadujících transfekci nebo genomickou modifikaci primárních lidských buněk.
„Schopnost Nucleofection snadno a účinně transfekovat primární lidské T-buňky bude přitahovat pozornost v přístupech genové terapie k léčbě onemocnění. Přístup společnosti Lonza k potenciálním aplikacím genové
terapie má také velmi malé rozměry. To je zásadní, protože ‚zbytky‘ strojů z jiných transfekčních technik mohou vést k nezamýšleným biologickým důsledkům,“ uzavírá Dr. Alberts.
Vědci společnosti Lonza vyhodnotili schopnost technologie Nucleofection společnosti transfekovat disociované buňky hladkého svalstva aorty dospělých potkanů (AoSMC). Kryokonzervované potkaní AoSMC byly rozmraženy a kultivovány po dobu sedmi dnů na 24jamkových kultivačních destičkách a buňky byly transfekovány v adherenci pomocí roztoku AD1 4D-Nucleofector Y. Dvacet čtyři hodin po transfekci byly buňky fixovány a analyzovány. Aktin je zobrazen červeně, GFP zeleně.
Formulatury
Mirus Bio vyvíjí a vyrábí nové transfekční formulace, které umožňují vysoce účinné a málo toxické doručení mnoha různých typů molekul nukleových kyselin. Mnohé z těchto formulací neobsahují složky živočišného původu. „Bez zvířat“ je důležitá vlastnost pro preklinické a klinické aplikace.
Systém CRISPR vyžaduje dodání vodicí RNA (gRNA) a expresi endonukleázy Cas9, která může být ve formě proteinu, mRNA nebo DNA. Společnost Mirus Bio nabízí transfekční řešení podporující účinné dodání všech různých molekul kódujících Cas9. Při použití chemických transfekčních metod pro dodání proteinu Cas9 mohou výzkumníci použít mnohem nižší množství proteinu, pokud je předem zkomplexován s gRNA.
„Některé obtížně transfekovatelné typy buněk poskytují vyšší účinnost štěpení při transfekci proteinu Cas9 zkomplexovaného v komplexu RNP (ribonukleoprotein),“ uvádí doktorka Laura Juckem, vedoucí skupiny R&D ve společnosti Mirus Bio. „Systém Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System účinně dodává komplexy RNP a umožňuje použití nižších koncentrací proteinu Cas9 ve srovnání s elektroporací.“
Další výzvou, které společnosti čelí, je přechod od adherentních kultur k suspenzním, aby bylo možné pojmout velké množství materiálu potřebného pro klinické studie. To platí zejména pro výrobu rekombinantního lenviru a adenoasociovaného viru (AAV). „Úzce spolupracujeme s našimi klienty, abychom zajistili, že jejich transfekce budou úspěšné a že změny v jejich pracovním postupu stále přinesou vysoce kvalitní produkt,“ vysvětluje Dr. Juckem.
„Pro buněčnou terapii byl vyvinut expresní systém CHO-gro®, který poskytuje vysoké výtěžky bioterapeutických proteinů v suspenzních buňkách CHO. Tento optimalizovaný systém podporuje růst buněk s vysokou hustotou a umožňuje výzkumníkům získat dostatečné množství bílkovin pro provádění preklinických studií a počátečních charakterizačních analýz,“ uzavírá Dr. Juckem.
Tento snímek z prezentace společnosti Mirus Bio popisující vysoce účinnou transfekci kmenových buněk naznačuje, že somatické buňky, jako jsou dospělé fibroblastové buňky, lze transfekovat nebo transdukovat pomocí několika metod s kombinací transkripčních faktorů. Jakmile jsou buňky přeprogramovány do pluripotentního stavu, lze je pomocí přidání růstových faktorů a/nebo transfekce selekčních markerů řízených promotory specifickými pro daný buněčný typ nasměrovat k různým osudům. Obrázek zdůrazňuje, že transfekční činidla lze do pracovního postupu s kmenovými buňkami přidat v několika bodech.
Celobuněčné přístupy
Thermo Fisher Scientific drží krok s potřebami zákazníků generovat biologicky relevantnější data s využitím primárních buněk namísto imortalizovaných buněčných linií. Primární buňky je tradičně obtížnější transfekovat chemickými metodami. Údaje získané z primárních buněčných kultur však obvykle poskytují odpovědi, které se lépe promítají do modelů celých zvířat in vivo.
Třírozměrné modely buněčných kultur, které poskytují relevantnější výsledky než dvourozměrné buněčné kultury, je obtížnější transfekovat tradičními metodami.
„Transfekce primárních kultur DNA je náročná. Použití siRNA (malé inhibiční ribonukleové kyseliny), mRNA (messengerové RNA) a přímo proteinu je primárními buňkami snadněji přijímáno, protože tyto sloučeniny stačí dopravit do cytoplazmy, a nikoli do buněčného jádra,“ uvádí doktor Xavier de Mollerat du Jeu,
„K doručení do jádra dochází při dělení buněk,“ pokračuje Dr. de Mollerat, „protože primární buňky se nedělí tak snadno jako buněčné linie, můžeme tento problém obejít doručením molekul do cytoplazmy, nikoli do jádra.“
Pokračujeme v hledání biologicky relevantnějších systémů na celých zvířatech: „Zjistili jsme, že použití přípravku Invivofectamine® 3.0 in vivo může účinně snížit expresi proteinu o 90 % v jaterních buňkách,“ vysvětluje Dr. de Mollerat. „Toto in vivo použití Invivofectamine poskytuje vědcům efektivnější model toho, jak vypadá léčba u celého zvířete.“
Další aplikací transfekční technologie je vývoj vakcín. Časový harmonogram vývoje vakcín lze nesmírně zkrátit použitím transfekovaných mRNA k expresi antigenů, proti nimž může organismus vyvinout imunitní odpověď. Vzhledem k množství nových virů, které se ve světě vyskytují, jako jsou viry Zika a chikungunya, možnost rychlého vývoje vakcín výrazně zlepší zdraví ve světě.
S pokračujícím vývojem imunitních terapií zaměřených na rakovinu jsou T-buňky často cíleny pomocí specifických receptorů. „Spolupracovali jsme se společnostmi, které mají zájem o vývoj těchto terapií,“ objasňuje Dr. de Mollerat. „Úzce spolupracujeme se společnostmi na řešení otázek, jak tyto léčby vyrábět, vyrábět tyto léčby ve velkém měřítku a zpřístupnit je po celém světě.“
Invivofectamine 3.0 je činidlo poskytované společností Thermo Fisher Scientific pro dodávání RNAi in vivo. Podle společnosti vede jediná injekce k významnému knockdownu v 1. den a po dobu až 3 týdnů. Toto zjištění vyplynulo ze studie, v níž bylo činidlo injikováno do ocasu hlodavce v různých dávkách (1, 0,5 a 0,25 mg/kg). Sérum bylo odebráno 2., 5., 9., 16., 23. a 30. den a bylo analyzováno na vyřazení proteinu FVII pomocí chromogenního testu. Společnost uvedla, že vyšší množství siRNA v injikovaných komplexech vedlo k dlouhodobějšímu vyřazení v testovaném rozsahu.