Transferová RNA

1 Úvod

skládání a stabilita tRNA jsou klíčové pro efektivní translaci a defekty v obou vlastnostech mohou vést ke snížení množství tRNA, což má za následek růstové defekty u kvasinek a onemocnění u lidí (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). U kvasinek Saccharomyces cerevisiae jsou známy dvě hlavní dráhy buněčné kontroly kvality, které degradují defektní druhy tRNA. První dráhou je dráha jaderného dohledu, která působí na pre-tRNA v jádře pomocí jaderného exosomu a komplexu TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova et al., 2005) tím, že degraduje pre-tRNAiMet postrádající modifikaci m1A58 nebo s chybně zpracovaným 3′ trailerem (Ozanick a kol., 2009) a část pre-tRNA divokého typu (WT) (Gudipati a kol., 2012). Druhou cestou je cesta rychlého rozpadu tRNA (RTD), která degraduje specifické zralé, hypomodifikované nebo destabilizované druhy tRNA prostřednictvím aktivity 5′-3′ exonukleáz Rat1 a Xrn1 (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD je vyvolána u mutantů postrádajících některou z několika modifikací v těle tRNA nebo prostřednictvím destabilizujících mutací a u všech identifikovaných substrátů RTD delece MET22 plně obnovuje hladinu tRNA a růst (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). Předpokládá se, že potlačení RTD u kmenů Met22Δ je způsobeno inhibicí exonukleáz Rat1 a Xrn1 metabolitem 3′-fosfoadenosin-5′-fosfátem, jehož hladina se při inhibici Met22 zvyšuje (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).

Ve druhém přístupu byly použity northern bloty ke zkoumání rychlosti i specifity degradace tRNA pro substráty RTD u teplotně citlivých modifikačních mutantů. Při tomto přístupu byla RNA izolovaná z buněk v různých časových bodech po teplotním posunu analyzována na hladiny specifických tRNA. Na základě této analýzy jsme zjistili, že 50 % tRNAVal(AAC) bylo degradováno u mutanta trm8Δ trm4Δ během 30 minut po posunu z 28 na 37 °C, zatímco podobně hypomodifikované tRNAiMet, tRNAMet a tRNAPhe nevykazovaly žádný pokles (Alexandrov a kol., 2006; Chernyakov, Whipple a kol., 2008). Dále bylo možné změřit relativní hladiny nabité a nenabité tRNA provedením northern blotu v kyselých podmínkách, který ukázal, že hladiny nabité tRNAVal(AAC) se u mutanta trm8Δ trm4Δ snížily o 50 % během 25 min teplotního posunu a že hladiny nenabité tRNAVal(AAC) se jevily jako neovlivněné (Alexandrov et al.,

Třetí přístup spočíval v supresi tRNA s vysokým počtem kopií, kdy byl do mutanta citlivého na teplotní modifikaci tRNA vnesen plazmid s vysokým počtem kopií exprimující určitou tRNA. Pokud byla tRNA substrátem RTD a teplotní citlivost byla důsledkem degradace jednoho druhu tRNA, pak by nadměrná exprese této tRNA vadu potlačila. Tak jsme zjistili, že teplotní citlivost mutanta trm8Δ trm4Δ byla potlačena vysokokopírovaným plazmidem exprimujícím tRNAVal(AAC), což naznačuje, že teplotní citlivost je primárně způsobena ztrátou tRNAVal(AAC) a že chybějící modifikace jsou důležité pro stabilitu tRNA (Alexandrov a kol., 2006). Podobně byly tímto přístupem identifikovány i RTD substráty několika dalších mutantů modifikace tRNA, včetně tRNASer(CGA) a tRNASer(UGA) u mutantů tan1Δ trm44Δ (chybí ac4C12 a Um44) a u mutantů trm1Δ trm4Δ (chybí m2,2G26 a m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe et al., 2012; Kotelawala et al., 2008).

Za čtvrté jsme použili přístup genetické náhrady k identifikaci RTD determinantů v rodině tRNASer tím, že jsme nahradili jediný esenciální gen tRNASer(CGA) (SUP61) různými variantami tRNASer(CGA) v kmeni WT a met22Δ a poté testovali růst při různých teplotách. Tímto přístupem jsme zjistili, že kombinovaná stabilita akceptoru a T-kmene je silným faktorem určujícím náchylnost k RTD v rodině genů tRNASer(CGA) (Whipple et al., 2011). Tento závěr byl dále podpořen pátým přístupem k měření RTD, při kterém jsme in vitro ukázali, že varianty tRNASer(CGA) bez ac4C12 a Um44 nebo s destabilizujícími mutacemi v akceptorovém kmeni jsou náchylnější k trávení Xrn1 a náchylnější k odstranění 5′ fosfátu telecí fosfatázou (Whipple et al.,

V tomto přehledu se budeme zabývat nedávno vyvinutým šestým a sedmým přístupem ke studiu substrátů RTD, které se ukázaly jako velmi cenné pro rozšíření našich znalostí o dráze RTD. Šestý přístup využívá fluorescenční reportér ke komplexní analýze knihoven tisíců variant tRNA v kmenech WT a met22Δ. Díky tomuto přístupu jsme identifikovali 643 pravděpodobných kandidátů na substráty RTD, z nichž mnohé se nacházejí v oblastech, u nichž se na základě předchozí práce neočekávalo, že budou vyvolávat RTD (Guy et al., 2014). Uvedeme údaje, které ukazují, že tento přístup lze použít ke studiu funkce tRNA za různých podmínek, a budeme diskutovat o dalších aplikacích tohoto přístupu.

Sedmý přístup využívá prodloužení jedového primeru k měření hladin tRNA v kmeni WT a met22Δ a je cenný svou schopností specificky měřit variantní tRNA i v přítomnosti tRNA WT, jejíž sekvence se může lišit pouze o jeden zbytek. Uvádíme podrobnou metodiku tohoto přístupu a diskutujeme některé jeho další možné aplikace.

.