Materiály:
30ml exponenciální kultury buněk SF9 v koncentraci 5×105 buněk/ml
6jamkových destiček (po 2)
1lahvička 4% agarózového gelu
1lahvička SF-900 (1.3X) médium
1sterilní láhev
0,5 ml baculovirového supernatantu
100 ml SFM
1. Za sterilních podmínek dávkujte 2 ml buněčné suspenze do každé jamky.
2. Nechte buňky usadit na dno destičky a zakryté inkubujte 1 h při RT.
3. Umístěte lahvičku s agarosovým gelem do vodní lázně o teplotě 70oC. Umístěte prázdnou láhev a SF-900 (1,3x) do lázně o teplotě 40oC.
4. Po 1hodinové inkubaci destiček při RT pozorujte monovrstvy pod inverzním mikroskopem, abyste potvrdili uchycení buněk a 50% konfluenci.
5. Po inkubaci destiček při teplotě 40oC umístěte do lázně o teplotě 40oC. Vytvořte osmilogové sériové ředění odebraného virového supernatantu postupným ředěním 0,5 ml předchozího ředění ve 4,5 ml média SFM ve 12 ml. Měli byste skončit s 8 zkumavkami obsahujícími vždy 10-1až 10-8 ředění původní virové zásoby.
7. Postupněodstraňte supernatant z každé jamky, zlikvidujte jej a okamžitě nahraďte 1 ml příslušného virového ředění do každé duplikované jamky. Inkubujte po dobu 1 h při RT.
8. Přesuňte láhve z vodní lázně do sterilní digestoře, jakmile agarosa zkapalní (20 až 30 min). 30 ml média SF-900 (1,3X) a 10 ml 4% agarosegelu rychle dávkujte do prázdné láhve a jemně promíchejte. Vraťte lahvičku s překryvnou vrstvou do vodní lázně o teplotě 40oC, dokud nebude použita.
9. Vraťte lahvičku do vodní lázně o teplotě 40oC. Po druhé 1hodinové inkubaci vraťte lahvičku s naředěnou agarózou a 6jamkové destičky do digestoře.
10. Postupně (od vysokého ředění po nízké) odstraňte virus z jamek a nahraďte ho 2 ml naředěné agarózy. Pracujte rychle, aby nedošlo k vyschnutí monovrstvy.Pasteurovou pipetou připojenou k vakuové pumpě snadno odstraníte stopy po inokulaci.
11. Před přesunem nechte gel 10 až 20 minut ztuhnout.
12. Inkubujte při teplotě 27oC ve zvlhčeném inkubátoru po dobu 4 až 10 dnů.
13. Inkubujte při teplotě 27oC ve vlhkém inkubátoru.Rekombinantní virus vytváří mléčné/šedé plaky mírného kontrastu viditelné bez barvení nebo jiných detekčních metod.
14. Denně monitorujte destičky, dokud se počet spočítaných plaků nezmění po dva po sobě následující dny.
15. Pro stanovení titru použitého inokula je optimální rozmezí pro počítání 3 až 20 plaků na jamku šestijamkové destičky. Titr (pfu/ml) lze vypočítat podle následujícího vzorce:
16. Překrytí agarózy barvivem Natural Red:
Připravte 0,5% roztok agarózy v SFM
Přidejte roztok přírodní červeně na konečnou koncentraci 50 mg/ml (zřeďte zásobní roztok 3,33 mg/ml v poměru 1:66,6).
Překryjte 1 ml roztoku barviva do každé jamky (na destičce se 6 jamkami).
.