Laboratoriedetektion og identifikation af Aspergillus-arter ved mikroskopisk observation og dyrkning: den traditionelle tilgang

Abstract

Molekylære og immunologiske test lover bedre og hurtigere laboratoriediagnostik af aspergillose, men mikroskopi og dyrkning er stadig almindeligt anvendte og vigtige værktøjer. Procedurelle ændringer samt en passende uddannelse af laboratoriepersonale kan øge værdien af disse traditionelle værktøjer. Anvendelse af Blankophor eller Calcofluor til mikroskopiske undersøgelser, bedre genkendelse af morfologiske karakteristika ved opportunistiske svampe i farvede udstrygninger af prøver, maksimering af væksthastigheden og produktionen af konidier fra Aspergillus spp. i kultur og genkendelse af atypiske varianter af almindelige aspergilli kan forbedre laboratoriets bidrag til hurtig diagnose. Undersøgelser viser, at antallet af laboratoriemedarbejdere er faldende i takt med, at efterspørgslen efter sundhedsydelser stiger. Effektiv rekruttering, fastholdelse og uddannelse af personale skal ske samtidig med teknologiske fremskridt.

Indledning

Traditionelle metoder til diagnosticering af aspergillose og andre mykoser suppleres med molekylære og immunologiske tilgange. Selv om fordelene ved nukleinsyrebaserede test er indlysende, er deres standardisering og kliniske anvendelighed ikke blevet fuldt ud realiseret . Selv om galactomannan EIA-testen for Aspergillus-antigen er bredt tilgængelig i USA, synes den standardiserede anvendelse af nukleinsyrebaserede test til identifikation af kliniske isolater at være begrænset. Referencelaboratorier, der tilbyder molekylær identifikation af aspergilli, omfatter Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Nederlandene, og laboratorier i USA, der er opført på Association for Molecular Pathology’s online testfortegnelse. Selv om molekylære metoder fortsat forbedres og bliver lettere tilgængelige, er mikroskopi og dyrkning fortsat de vigtigste laboratorieværktøjer til påvisning af aspergilli. Den benchmarkingundersøgelse, som American Society for Microbiology (ASM) foretog i 2003, dokumenterede, at 89 % af de laboratorier, der udfører mykologiske test, anvender kultur, 16 % anvender serologi, og mindre end 5 % anvender molekylære test. Kun 3 % af de indberettende laboratorier anvender “hjemmelavede” molekylære test for mikrobielle patogener. I betragtning af den fortsatte afhængighed af mikroskopi og dyrkning skal disse metoders diagnostiske værdi forbedres ved hjælp af procedureændringer og passende uddannelse af laboratoriepersonalet.

Mikroskopi

Mikroskopiske metoder, såsom wet mounts, Gram-færgninger og konventionel histopatologi, giver ledetråde, der antyder tilstedeværelsen af Aspergillus spp. i væv. Blankophor eller Calcofluor blandet med 10-20 % kaliumhydroxid (KOH) farvelægger svampes cellevægge og forbedrer påvisningen af svampe. Mens Calcofluor krystalliserer i en alkalisk pH-værdi, gør Blankophor det ikke, og det kan opbevares i en arbejdsopløsning i op til et år. Fænotypiske markører, der påvises ved histopatologiske farvninger samt ved gramfarvning eller wet mounts, giver værdifulde oplysninger om klinisk vigtige svampe, især i mangel af dyrkning (tabel 1). Det er dog altid ønskeligt at få bekræftet de mikroskopiske fund ved dyrkning, og i de fleste tilfælde, hvor der er tale om opportunistiske skimmelsvampe, er det afgørende for en endelig identifikation af patogenet. På trods af tilstedeværelsen af visuelle spor kan identifikation af aspergilli ved mikroskopi alene være misvisende. Schell rapporterer om et tilfælde af Aspergillus niger sinusitis, hvor A. niger-konidier blev forvekslet med gærceller fra Candida spp. og tværsnit af A. nigers stipes blev forvekslet med de brede hyfer fra en zygomycet. Kommunikation mellem den kliniske patolog og laboratoriemykologen, som rutinemæssigt identificerer filamentøse svampe fra kultur, kan forbedre den diagnostiske værdi af histopatologi.

Opdagelse af morfologiske karakteristika

Da aspergilli er allestedsnærværende i naturen, kan de almindeligvis kontaminere prøver og kulturmedier. Derfor er det ofte en udfordring at bestemme betydningen af Aspergillus spp., der vokser i kultur, når mikroskopisk undersøgelse af prøven er negativ. I en undersøgelse af Aspergillus-isolater fra lever- og nyretransplantatmodtagere fandt Brown et al., at tilstedeværelsen af mere end to kolonier i en kultur og infektion på mere end ét sted forudsagde en betydelig infektion. Hos granulocytopeniske patienter med akut leukæmi skal en enkelt isolering fra en prøve fra de nedre luftveje betragtes som signifikant . Entydige rapporter om laboratorieobservationer til lægen kan mindske det diagnostiske dilemma. For eksempel giver erklæringen “I alt tre kolonier af Aspergillus fumigatus isoleret på to ud af tre plader” mere information end “Sjældent A. fumigatus isoleret”.

Optimering af dyrkningsresultater

Isolering i kultur og fænotypisk identifikation af almindelige kliniske isolater af Aspergillus spp. er normalt hurtig og let. Kultur beskrives imidlertid ofte som langsom, hvilket måske skaber misforståelser om dens værdi til påvisning af aspergilli. A. fumigatus vokser hurtigt. De typiske velutinøse, gråblågrønne kolonier og ensartede konidiehoveder udvikles inden for 24-48 timer på både svampemedier og den fåreblodagar, der almindeligvis anvendes til bakteriekultur. Andre aspergiller, der er forbundet med invasiv aspergillose, nærmere bestemt A. flavus, A. niger, A. nidulans og A. terreus, har samme væksthastighed som A. fumigatus, når kolonier blev målt på maltekstraktagar og Czapek-gæragar efter inkubation i syv dage ved både 25 °C og 37 °C . Da lægemiddelresistens hos nogle Aspergillus spp. er en trussel, er det berettiget at foretage en fuldstændig identifikation, ikke kun af A. fumigatus, men også af de mindre almindeligt isolerede arter. Laboratorieforskere skal også kunne genkende atypiske isolater af Aspergillus spp. For nylig blev der rapporteret om dårligt sporulerende (hvide) stammer af A. fumigatus med nedsat modtagelighed over for flere svampedræbende lægemidler . Disse hvide stammer har en anden genetisk sekvens end vildtypen A. fumigatus Fresenius og udviklede ikke de typiske blågrønne konidiehoveder før 10-12 dage efter inkubation. En anden udfordring er den hvide skimmel, Neosartorya fisheri, som i begyndelsen producerer sparsomme, konidiehoveder, der ligner dem fra A. fumigatus. N. fisheri udvikler dog efterfølgende mange runde, tyndvæggede cleistothecier, hvilket gør det nemt at skelne dem fra A. fumigatus. En dissektionskikkert er praktisk til hurtig lokalisering af konidiehoveder og cleistothecier. Der kan forekomme sterile, hvide, hurtigtvoksende eller glatte, højhårede, langsomtvoksende isolater af A. fumigatus, som kræver termotolerance- og eksoantigenundersøgelse for endelig identifikation . Khan et al. rapporterede en atypisk A. terreus isoleret fra prøver fra de nedre luftveje fra en patient med aspergillom. De første kolonier var orange og producerede et diffust gult pigment og små, enkelte celler, der blev forvekslet med konidier af Scedosporium apiospermum. Udfældningsantistoffer og typiske konidiehoveder fra A. terreus, der blev produceret efter 10 ugers inkubation, bekræftede identifikationen.

De billeder og oplysninger, der er tilgængelige i lærebøger og på internettet, giver gode uddannelsesmuligheder for at lære at identificere Aspergillus spp. Praktisk erfaring er dog fortsat det mest effektive undervisningsredskab. CDC, National Laboratory Training Network (NLTN) og CBS tilbyder laboratorieworkshops. Når det ikke er praktisk muligt at rejse uden for laboratoriet, opfordres laboratorierne til at bruge online-vejledningen, Aspergillus Reference Cultures , til intern uddannelse. De referenceorganismer, der er anført der, kan købes fra større kultursamlinger.

Analyse af hvert trin i dyrkningsproceduren kan føre til forbedret genfinding af aspergilli. Det er blevet foreslået, at man ved hjælp af sputolysin eller andre mucolytiske midler kan udvindes svampe, der er fanget i slimet i sputum og bihulemateriale fra endoskopisk kirurgi . Anvendelse af kartoffeldextrose, kartoffelflager, maltekstrakt, hæmmende skimmelagar eller lignende sporulationsagar som primære isoleringsmedier for Aspergillus spp. kan fremskynde væksthastigheden og produktionen af konidier. Tilsætning af antibakterielle midler til isoleringsmedier bidrager til at reducere tiden til identifikation ved at hæmme bakteriel overvækst og reducere behovet for subkultur. Den indledende inkubation af svampemedier ved 35-37 °C i stedet for eller i tillæg til 30 °C kan fremskynde væksten af visse aspergilli . Ligeledes sikrer daglig inspektion af kulturmedier den tidligst mulige påvisning. Ved at inkubere kulturplader i et mikroaerofilt miljø ved 35 °C fandt Tarrand, at udvalgte, klinisk vigtige Aspergillus spp. voksede fra 12 ud af 12 bouillonkulturer. Kulturer af de samme organismer, der blev inkuberet ved 25 °C uden CO2, gav ingen positive resultater. Yderligere undersøgelser vil være nyttige for at klarlægge, hvilke medier og betingelser der er mest effektive til genvinding og hurtig identifikation af klinisk vigtige aspergilli.

Med en hurtig Scotch-tape- eller tease-montering kan konidiehoveder af Aspergillus spp. typisk identificeres. Det kan dog være nødvendigt med en objektglaskultur, når sporulationen er langsom eller atypisk. Det hurtige tempo i de fleste hospitalslaboratorier dikterer den nemmeste, om end ikke nødvendigvis den mest raffinerede, metode til udførelse af objektglaskulturen. Riddells klassiske metode er blevet suppleret med andre, mindre arbejdskrævende teknikker . En hurtig metode er simpelthen at skubbe et 18 × 18 mm stort dækglas i en 45 graders vinkel ned i et sporulationsmedie, f.eks. kartoffelflageragar. Når skimmelsvampen sporulerer, trækkes dækglasset forsigtigt ud af agaren og anbringes i en dråbe lacto-phenolblåt eller lacto-fuchsin på et objektglas. Endnu en dråbe anbringes oven på det lille dækglas, inden monteringen afsluttes med et 22 × 22 mm stort dækglas.

Fagpersonaleproblemer

Hurtig diagnosticering af aspergillose afhænger ikke kun af en forbedret metodologi, men også af en tilstrækkelig, veluddannet arbejdsstyrke. Undersøgelser af mykologipraksis anbefaler kraftigt mere uddannelse . Der bør lægges særlig vægt på nøjagtig identifikation, direkte undersøgelse, hensigtsmæssig brug af medier, klinisk relevans og omkostningseffektivitet. Utilstrækkelig bemanding kan imidlertid bringe både uddannelse og gennemførelse af mere klinisk relevante procedurer i fare. ASM’s benchmarkingundersøgelse viste, at der fortsat er mangel på arbejdskraft i nogle mikrobiologiske laboratorier i USA. Manglen skyldes til dels en reduktion på 53-56 % i CLS-uddannelsesprogrammerne i løbet af de seneste 12 år. 34 % af de fagfolk, der arbejder i mikrobiologiske laboratorier i dag, er mere end 50 år gamle. Vil der være yngre arbejdstagere til rådighed til at erstatte dem, når de går på pension? Mens næsten 80 % af kvinderne i arbejdsstyrken er yngre end 30 år, er kun 10 % af de kvindelige arbejdstagere i mikrobiologiske laboratorier under 30 år gamle . Disse data tyder på, at manglen på arbejdskraft vil fortsætte og muligvis forværres.

Slutning

For at forbedre både traditionelle og ikke-traditionelle diagnostiske procedurer for mykoser kræves der en samtidig indsats for at sikre en tilstrækkelig arbejdsstyrke og forbedre karrieremobiliteten, den faglige anerkendelse, mulighederne for videreuddannelse, kompensation og andre faktorer, der er nødvendige for at stimulere interessen for laboratorievidenskab.