Laboratorium detectie en identificatie van Aspergillus species door microscopische observatie en kweek: de traditionele aanpak

Abstract

Moleculaire en immunologische testen beloven een betere en snellere laboratorium diagnose van aspergillose, maar microscopie en kweek blijven veelgebruikte en essentiële instrumenten. Veranderingen in de procedures en een adequate opleiding van laboratoriumspecialisten kunnen de waarde van deze traditionele instrumenten verhogen. Het gebruik van Blankophor of Calcofluor voor microscopische onderzoeken; het verbeteren van de herkenning van morfologische kenmerken van opportunistische schimmels in gekleurde uitstrijkjes van specimens; het maximaliseren van de groeisnelheid en de productie van conidia door Aspergillus spp. in kweek; en het herkennen van atypische varianten van gewone aspergilli kan de bijdrage van het laboratorium aan een snelle diagnose verbeteren. Uit enquêtes blijkt dat het aantal laboratoriummedewerkers afneemt terwijl de vraag naar gezondheidszorg toeneemt. Effectieve werving, behoud en opleiding van personeel moet gelijk opgaan met de vooruitgang in technologie.

Inleiding

Traditionele methoden voor de diagnose van aspergillose en andere mycosen worden aangevuld met moleculaire en immunologische benaderingen. Hoewel de voordelen van op nucleïnezuur gebaseerde tests duidelijk zijn, zijn hun standaardisatie en klinische bruikbaarheid nog niet volledig gerealiseerd. Hoewel de galactomannan EIA-test voor Aspergillus-antigeen in de VS op grote schaal beschikbaar is, lijkt het standaardgebruik van op nucleïnezuur gebaseerde tests voor de identificatie van klinische isolaten beperkt. Tot de referentielaboratoria die moleculaire identificatie van aspergilli aanbieden behoren de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, het Centraal Bureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Nederland, en laboratoria in de VS die zijn opgenomen in de online test directory van de Association for Molecular Pathology. Hoewel de moleculaire methoden steeds beter en gemakkelijker beschikbaar worden, blijven microscopie en kweek de belangrijkste laboratoriuminstrumenten voor het opsporen van aspergilli. In de benchmarking-enquête van de American Society for Microbiology (ASM) van 2003 staat dat 89% van de laboratoria die mycologische tests uitvoeren, kweek gebruiken, 16% serologie gebruiken en minder dan 5% moleculaire tests gebruiken. Slechts 3% van de rapporterende laboratoria gebruikt “zelfgemaakte” moleculaire tests voor microbiële pathogenen. Gezien de voortdurende afhankelijkheid van microscopie en kweek, moet de diagnostische waarde van deze methoden worden verbeterd door procedurele veranderingen en adequate opleiding van laboratoriumpersoneel.

Microscopie

Microscopische methoden, zoals natte preparaten, Gram-kleuren, en conventionele histopathologie, bieden aanwijzingen die wijzen op de aanwezigheid van Aspergillus spp. in weefsel. Blankophor of Calcofluor gemengd met 10%-20% kaliumhydroxide (KOH), kleurt de celwanden van schimmels en verbetert de detectie van schimmels. Calcofluor kristalliseert in een alkalische pH-waarde, terwijl Blankophor dat niet doet en het in een werkoplossing tot een jaar kan worden bewaard. Fenotypische markers die met histopathologische kleuring, Gram-kleuring of natte preparaten worden opgespoord, geven waardevolle informatie over klinisch belangrijke schimmels, vooral als er geen kweek beschikbaar is (tabel 1). Bevestiging van de microscopische bevindingen door kweek is echter altijd wenselijk en, in de meeste gevallen van opportunistische schimmels, essentieel voor de definitieve identificatie van de ziekteverwekker. Ondanks de aanwezigheid van visuele aanwijzingen, kan identificatie van aspergilli door microscopie alleen misleidend zijn. Schell rapporteert een geval van Aspergillus niger sinusitis waarbij de A. niger conidia verward werden met de gistcellen van Candida spp. en dwarsdoorsneden van de stipes van A. niger verward werden met de brede hyphae van een zygomycete. Communicatie tussen de klinisch patholoog en de laboratorium mycoloog, die routinematig filamenteuze schimmels identificeert uit kweek, kan de diagnostische waarde van histopathologie verbeteren.

>

Herkenning van morfologische kenmerken

Omdat aspergilli alomtegenwoordig zijn in de natuur, kunnen zij vaak specimens en kweekmedia verontreinigen. Bijgevolg is het bepalen van de betekenis van Aspergillus spp. die in cultuur groeien vaak een uitdaging wanneer microscopisch onderzoek van het specimen negatief is. In een onderzoek van Aspergillus-isolaten van lever- en niertransplantatie-ontvangers vonden Brown et al. dat de aanwezigheid van meer dan twee kolonies in een kweek en infectie op meer dan één plaats een significante infectie voorspelde. Bij granulocytopeniepatiënten met acute leukemie moet een enkele isolatie uit een monster van de lagere luchtwegen als significant worden beschouwd. Ondubbelzinnige rapportage van laboratoriumwaarnemingen aan de arts kan het diagnostische dilemma verminderen. Bijvoorbeeld, de verklaring, “Een totaal van drie kolonies van Aspergillus fumigatus geïsoleerd op twee van drie platen” geeft meer informatie dan “Zeldzame A. fumigatus geïsoleerd”.

Optimaliseren van resultaten van kweek

Isolatie in kweek en fenotypische identificatie van veel voorkomende klinische isolaten van Aspergillus spp. is meestal snel en gemakkelijk. Kweek wordt echter vaak als traag beschreven, wat misschien misvattingen schept over de waarde ervan voor de detectie van aspergilli. A. fumigatus is een snelle groeier. De typische velutineuze, grijs-blauw-groene kolonies en uniseriate conidiumkoppen ontwikkelen zich binnen 24-48 uur op zowel schimmelmedia als de schapenbloedagar die gewoonlijk voor bacteriekweek wordt gebruikt. Andere aspergilli die in verband worden gebracht met invasieve aspergillose, met name A. flavus, A. niger, A. nidulans en A. terreus, vertonen groeisnelheden die vergelijkbaar zijn met die van A. fumigatus wanneer kolonies werden gemeten op moutextractagar en Czapek-gistagar na incubatie gedurende zeven dagen bij zowel 25°C als 37°C . Omdat geneesmiddelenresistentie van sommige Aspergillus spp. een bedreiging vormt, is volledige identificatie, niet alleen van A. fumigatus, maar ook van de minder vaak geïsoleerde soorten, gerechtvaardigd. Laboratoriumonderzoekers moeten ook atypische isolaten van Aspergillus spp. herkennen. Onlangs zijn slecht sporulerende (witte) stammen van A. fumigatus met verminderde gevoeligheid voor verschillende antischimmelmiddelen gemeld. Deze witte stammen hebben een genetische sequentie die verschilt van die van het wilde type, A. fumigatus Fresenius, en ontwikkelen pas 10-12 dagen na incubatie de typische blauwgroene conidiaalkoppen. Een andere uitdaging is de witte schimmel Neosartorya fisheri, die aanvankelijk spaarzame conidia produceert die lijken op die van A. fumigatus. N. fisheri ontwikkelt echter talrijke, ronde, dunwandige cleistothecia, waardoor het onderscheid met A. fumigatus eenvoudig wordt. Een dissectiescoop is handig voor een snelle lokalisatie van conidiaalkoppen en cleistothecia. Er kunnen steriele, witte, snelgroeiende of glazige, opeengehoopte, traaggroeiende isolaten van A. fumigatus voorkomen, waarvoor thermotolerantie en exoantigeentests nodig zijn voor een definitieve identificatie. Khan et al. rapporteerden een atypische A. terreus geïsoleerd uit monsters van de lagere luchtwegen van een patiënt met aspergilloma. De initiële kolonies waren oranje en produceerden een diffusibel geel pigment en kleine, enkelvoudige cellen die verward werden met de conidia van Scedosporium apiospermum. Neerslag van antilichamen en typische conidia van A. terreus, geproduceerd na 10 weken incubatie, bevestigden de identificatie.

De afbeeldingen en informatie beschikbaar in leerboeken en op het Internet bieden goede leermogelijkheden om Aspergillus spp. te leren identificeren. Hands-on ervaring blijft echter het meest effectieve leermiddel. De CDC, het National Laboratory Training Network (NLTN), en het CBS bieden laboratoriumworkshops aan. Wanneer reizen naar een andere locatie niet praktisch is, worden laboratoria aangemoedigd om de online tutorial Aspergillus Reference Cultures te gebruiken voor interne opleiding. De daar vermelde referentieorganismen zijn te koop bij grote kweekcollecties.

Het analyseren van elke stap in de kweekprocedure kan leiden tot een betere terugwinning van aspergilli. Het vloeibaar maken van monsters met sputolysine of andere slijmoplossende middelen is voorgesteld voor het terugwinnen van schimmels die vastzitten in het slijm van sputum en sinusmateriaal dat na endoscopische chirurgie is teruggewonnen. Het gebruik van aardappel dextrose, aardappelvlokken, moutextract, remmende schimmelagar, of soortgelijke sporulatie-agars als primaire isolatiemedia voor Aspergillus spp. kan de groeisnelheid en de productie van conidia versnellen. De toevoeging van antibacteriële stoffen aan isolatiemedia helpt de tijd tot identificatie te verkorten door bacteriële overgroei te remmen en de noodzaak van subcultuur te verminderen. De initiële incubatie van schimmelmedia bij 35-37°C in plaats van, of in aanvulling op, 30°C kan de groei van sommige aspergilli versnellen. Ook een dagelijkse inspectie van de kweekmedia zorgt voor een zo vroeg mogelijke opsporing. Door kweekplaten in een microaërobe omgeving bij 35 °C te incuberen, ontdekte Tarrand dat geselecteerde, klinisch belangrijke Aspergillus spp. groeiden uit 12 van 12 bouillonculturen. Culturen van dezelfde organismen, geïncubeerd bij 25°C zonder CO2, leverden geen positieve resultaten op. Verdere studies zouden nuttig zijn om te verduidelijken welke media en condities het meest effectief zijn voor de recovery en snelle identificatie van klinisch belangrijke aspergilli.

Met een snelle Scotch-tape of tease mount, kunnen conidiaalkoppen van Aspergillus spp. gewoonlijk worden geïdentificeerd. Bij trage of atypische sporulatie kan echter een objectglaasjeskweek nodig zijn. Het snelle tempo van de meeste ziekenhuislaboratoria dicteert de gemakkelijkste, hoewel niet noodzakelijk de meest verfijnde, methode voor het uitvoeren van de objectglaasjeskweek. De klassieke methode van Riddell voor het kweken van objectglaasjes is aangevuld met andere, minder arbeidsintensieve technieken. Een snelle methode is eenvoudig een dekglaasje van 18 × 18 mm onder een hoek van 45 graden in een sporulatiemedium te duwen, zoals aardappelvlokagar. Wanneer de schimmel sporuleert, wordt het dekglaasje voorzichtig uit de agar gehaald en in een druppel lacto-fenolblauw of lacto-fuchsine op een microscoopglaasje gemonteerd. Bovenop het kleine dekglaasje wordt nog een druppel aangebracht alvorens de montage te voltooien met een dekglaasje van 22 × 22 mm.

Medewerkersproblemen

Snelle diagnose van aspergillose hangt niet alleen af van verbeterde methodologie maar ook van adequaat, goed opgeleid personeel. Enquêtes over mycologiepraktijken bevelen sterk meer opleiding aan. Speciale nadruk moet worden gelegd op nauwkeurige identificatie, direct onderzoek, passend gebruik van media, klinische relevantie en kosteneffectiviteit. Onvoldoende personeel kan echter zowel de opleiding als de uitvoering van klinisch relevantere procedures in het gedrang brengen. Uit de ASM Benchmarking Survey blijkt dat er in sommige microbiologische laboratoria in de VS nog steeds een tekort is aan personeel. Gedeeltelijk is het tekort het gevolg van een daling van 53%-56% in CLS-opleidingsprogramma’s in de afgelopen 12 jaar. Vierendertig procent van de professionals die vandaag in microbiologische laboratoria werken, zijn ouder dan 50 jaar. Zullen er jongere werknemers beschikbaar zijn om hen te vervangen wanneer zij met pensioen gaan? Terwijl bijna 80% van de vrouwen in de beroepsbevolking jonger is dan 30 jaar, is slechts 10% van de vrouwelijke werknemers in microbiologische laboratoria jonger dan 30 jaar. Deze gegevens suggereren dat het tekort aan arbeidskrachten zal aanhouden en mogelijk verergeren.

Conclusie

Verbetering van zowel traditionele als niet-traditionele diagnostische procedures voor mycosen vereisen gelijktijdige inspanningen om te zorgen voor een adequaat personeelsbestand en om de carrièremobiliteit, professionele erkenning, mogelijkheden voor geavanceerde opleiding, compensatie en andere factoren die nodig zijn om de belangstelling voor laboratoriumwetenschap te stimuleren, te verbeteren.