D Komplexbildung
Die Bildung der Prothrombinase stellt ein wichtiges katalytisches Modulierungsereignis dar, da der vollständige Komplex 300.000-mal effizienter ist als der freie Faktor Xa, der in Lösung auf Prothrombin einwirkt.24,72 Eine Folge dieser signifikanten Ratenerhöhung ist, dass jede Dissoziation von Komponenten aus dem Komplex die Enzymaktivität signifikant und drastisch verringert. Das Fehlen der Membranoberfläche des vollständigen Katalysators führt zu einem 1000-fachen Verlust an katalytischer Effizienz, während die Entfernung von Faktor Va aus dem Komplex eine 10.000-fache Verringerung der Thrombinbildungsrate zur Folge hat.24 Die Membranoberfläche ist obligatorisch erforderlich, da sie, obwohl sie nur wenig zur intrinsischen Katalyserate beiträgt, eine Umgebung bereitstellt, in der sich sowohl der Faktor-Va-Faktor-Xa-Komplex als auch das Substrat konzentrieren können.277 Prothrombin scheint sich an der Thrombozytenmembranoberfläche größtenteils durch die oben beschriebenen rezeptorvermittelten Mechanismen zu konzentrieren. Faktor Va bildet aufgrund seiner Membranbindungskapazität eine obligate und hochaffine Interaktion mit Faktor Xa, da Faktor Xa in Abwesenheit von Faktor Va nicht an aktivierte Thrombozyten gebunden wird. Die Konzentration der Reagenzien an der Membranoberfläche führt zu hohen lokalen Konzentrationen von Reagenzien, die den intrinsischen Km der Reaktion übersteigen und die katalytische Effizienz erheblich verbessern. Darüber hinaus erhöht Faktor Va die Umsatzrate der Reaktion durch einen Mechanismus, der noch nicht geklärt ist.278
Die Komplexbildung bietet Prothrombinase-Bestandteilen auch Schutz vor Inhibitoren und/oder Inaktivatoren. Im Gegensatz zum freien Faktor Xa in Lösung ist der in die Prothrombinase inkorporierte Faktor Xa (d.h. komplexiert mit dem membrangebundenen Faktor Va) vor der Hemmung durch Antithrombin III und Heparin geschützt.72 Ebenso ist der in die Prothrombinase inkorporierte Faktor Va vor der proteolytischen Inaktivierung durch das aktivierte Protein C109,110 geschützt – ein Prozess, der im folgenden Abschnitt ausführlich erörtert wird.
Die intrinsische Xase wird durch eine Vielzahl von Mechanismen moduliert, die denen ähnlich sind, die bei der Prothrombinase beobachtet wurden. Die Komplexbildung führt zu einer etwa 2 × 107-fachen Erhöhung der katalytischen Effizienz.217 Die Bindung der Faktoren VIIIa und IXaβ an Thrombin-aktivierte Thrombozyten verringert den Km für die Faktor-X-Aktivierung um das 2500-fache und ermöglicht es Faktor VIIIa, die kcat um das 7500-fache zu erhöhen. Antithrombin III kann Faktor IXaβ in Gegenwart von Faktor VIIIa und Thrombozyten nicht hemmen.279 Ähnlich wie bei Faktor Va moduliert die Komplexbildung von Faktor VIIIa mit Faktor IXaβ dessen Aktivität. Die Dissoziation der A2-Untereinheit vom Heterotrimer Faktor VIIIa, die zu einem vollständigen Verlust der Kofaktoraktivität führt, wird durch seine Assoziation mit Faktor IXaβ auf einer Membranoberfläche verhindert,280 ebenso wie seine Inaktivierung durch APC.62,281
Da Faktor Va für die physiologisch relevante Thrombinbildung absolut erforderlich ist, können signifikante Variationen der Prothrombinaktivierung durch proteolytische, inaktivierende Veränderungen des Kofaktors erreicht werden, die durch aktiviertes Protein C katalysiert werden. Proteolyse und Inaktivierung setzen voraus, dass der Faktor Va plättchen59,74 oder membrangebunden ist.282 Frühe Studien wiesen darauf hin, dass die Inkubation von aktiviertem Protein C mit Thrombin-aktivierten Thrombozyten zu einer parallelen Abnahme der Bindung von Faktor Xa und der Aktivierung von Prothrombin führte, was darauf hindeutet, dass der Faktor Va nach der Spaltung durch aktiviertes Protein C den Faktor Xa nicht bindet.283,284 Daher hat die durch aktiviertes Protein C katalysierte Inaktivierung von Faktor Va eine dramatische Auswirkung auf die Thrombinbildung.
Humane Thrombozyten sind in der Lage, die durch aktiviertes Protein C katalysierte Inaktivierung von aus Plasma und Thrombozyten stammendem Faktor Va zu fördern und zu modulieren, obwohl diese beiden Kofaktor-Pools in Bezug auf die Inaktivierung keine gleichwertigen Substrate sind. Drei Spaltungen in der schweren Kette des menschlichen Faktor-Va-Moleküls sind für eine effiziente aktivierte Protein-C-katalysierte Inaktivierung erforderlich: Spaltung an Arg506, gefolgt von Spaltungen an Arg306 und Arg679,282,285 Die Spaltung an Arg506 ist schneller und geht der membranabhängigen, inaktivierenden Spaltung an Arg306 voraus,282 Die durch Thrombin aktivierte menschliche Thrombozytenoberfläche spielt eine wichtige Rolle bei der durch aktiviertes Protein C katalysierten Inaktivierung von aus Thrombozyten stammendem Faktor Va und der Faktor-Va-Variante, Faktor VaLeiden.109,110 Faktor VaLeiden entsteht durch Thrombinaktivierung von Faktor VLeiden, einer Variante, bei der Arg506 durch Glutamin ersetzt wurde, wodurch die Spaltstelle für aktiviertes Protein C an Position 506 im Wesentlichen entfernt wurde.286 Homozygote (und in einigen Fällen heterozygote) Personen mit dieser Mutation haben daher eine schlechte gerinnungshemmende Reaktion auf aktiviertes Protein C und ein erhöhtes Risiko für venöse Thrombosen.287-289 Die normalen und mutierten Thrombozyten-Cofaktoren werden durch aktiviertes Protein C in nahezu identischer Geschwindigkeit inaktiviert; eine vollständige Inaktivierung der beiden von den Thrombozyten stammenden Cofaktoren wird jedoch nie erreicht,109,110 da bis zu 50 % der ursprünglichen Aktivität erhalten bleiben. Diese Ergebnisse stehen in deutlichem Gegensatz zu dem, was in Studien über die durch aktiviertes Protein C katalysierte Inaktivierung von aus Plasma stammendem Faktor Va und Faktor VaLeiden auf synthetischen Phospholipidvesikeln beobachtet wurde.290-292 In diesen Studien wird stets eine vollständige Inaktivierung der Kofaktoren beobachtet, obwohl der Plasma-Faktor VaLeiden wesentlich langsamer inaktiviert wird als der normale Plasma-Faktor Va. In Thrombozytenstudien verbleibt eine größere Restaktivität sowohl des aus Thrombozyten stammenden Faktors Va als auch des Faktors VaLeiden, wenn Thrombin-aktivierte Thrombozyten als inaktivierende Membranoberfläche verwendet werden, im Gegensatz zu der nahezu vollständigen Inaktivierung, wenn synthetische Phospholipidvesikel als inaktivierende Oberfläche verwendet werden.110 Somit schützen aktivierte Thrombozyten die aus Thrombozyten stammenden Kofaktoren vor der durch aktiviertes Protein C katalysierten Inaktivierung.109,110
Aktivierte Thrombozyten schützen auch den normalen, aus dem Plasma stammenden Faktor Va vor der Inaktivierung durch aktiviertes Protein C, indem sie die Spaltung an Arg506 verlangsamen.110 Im Gegensatz zu dem aus den Thrombozyten stammenden Cofaktor kann der aus dem Plasma stammende Faktor Va jedoch vollständig durch aktiviertes Protein C inaktiviert werden, was darauf hindeutet, dass die beiden unterschiedlichen Cofaktor-Pools (Plasma vs. Thrombozyten) unterschiedliche Substrate für APC sind.110 Diese Studien bestätigen erneut die Bedeutung von Bindungsereignissen bei der Modulation der Prothrombinase-Aktivität. Sie zeigen auch, dass Thrombozyten- und synthetische Phospholipidmembranen bei der Regulierung der Enzymkomplexbildung keine gleichwertigen Oberflächen darstellen. Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass Thrombozyten prokoagulatorische Ereignisse aufrechterhalten, indem sie eine Membranoberfläche bereitstellen, die die Inaktivierung von Kofaktoren verzögert, und indem sie ein Kofaktormolekül freisetzen, das einen gegen aktiviertes Protein C resistenten Phänotyp aufweist.
Interessant ist die Überlegung, dass die Faktor-VLeiden-Mutation an Stellen einer arteriellen Verletzung möglicherweise nicht so leicht eine arterielle Thrombose vorhersagt, da die normalen und variantenbedingten Thrombozyten-Kofaktoren an der aktivierten Thrombozytenoberfläche gleichermaßen resistent gegen aktiviertes Protein C sind. Die nachgewiesene Rolle der Faktor-VLeiden-Mutation bei der Vorhersage venöser Thrombosen287-289 spiegelt möglicherweise die nachgewiesene Resistenz des aus dem Plasma stammenden Faktor-VaLeiden-Kofaktors im Vergleich zum normalen, aus dem Plasma stammenden Faktor-Va wider.290-292 Der Plasma-Kofaktor-Pool könnte bei venösen Thrombosen eine größere Rolle spielen, da ein signifikanter Beitrag der Blutplättchen fehlt. Im Gegensatz dazu kann der aus den Blutplättchen stammende Kofaktor an der Stelle eines arteriellen Thrombus infolge seiner Freisetzung und Aktivierung in einer Konzentration vorliegen, die mehr als 600-mal so hoch ist wie die des Plasmakofaktors.106