Detección e identificación en el laboratorio de especies de Aspergillus mediante observación microscópica y cultivo: el enfoque tradicional

Reconocimiento de las características morfológicas

Dado que los aspergilli son ubicuos en la naturaleza, pueden contaminar comúnmente las muestras y los medios de cultivo. En consecuencia, determinar la importancia de Aspergillus spp. que crece en el cultivo es a menudo un reto cuando el examen microscópico de la muestra es negativo. En un estudio sobre los aislamientos de Aspergillus de receptores de trasplantes de hígado y riñón, Brown et al. descubrieron que la presencia de más de dos colonias en un cultivo y la infección en más de un lugar predecían una infección significativa. En pacientes granulocitopénicos con leucemia aguda, un solo aislamiento de una muestra de las vías respiratorias inferiores debe considerarse significativo. Los informes inequívocos de las observaciones del laboratorio al médico pueden reducir el dilema diagnóstico. Por ejemplo, la afirmación «Un total de tres colonias de Aspergillus fumigatus aisladas en dos de tres placas» proporciona más información que «Se aisló un A. fumigatus poco frecuente».

Optimización de los resultados del cultivo

El aislamiento en cultivo y la identificación fenotípica de los aislados clínicos comunes de Aspergillus spp. suele ser rápida y sencilla. Sin embargo, el cultivo se describe a menudo como lento, lo que quizás crea ideas erróneas sobre su valor para la detección de aspergilos. A. fumigatus es de crecimiento rápido. Las típicas colonias velutinas de color gris-azulado-verde y las cabezas conidiales uniseriadas se desarrollan en 24-48 horas tanto en medios fúngicos como en el agar sangre de oveja que se utiliza habitualmente para el cultivo bacteriano. Otros aspergilos asociados a la aspergilosis invasiva, en concreto, A. flavus, A. niger, A. nidulans y A. terreus tienen tasas de crecimiento similares a las de A. fumigatus cuando se miden las colonias en agar de extracto de malta y en agar de levadura Czapek después de incubarlas durante siete días tanto a 25°C como a 37°C . Dado que la resistencia a los fármacos de algunos Aspergillus spp. es una amenaza, se justifica la identificación completa, no sólo de A. fumigatus, sino también de las especies menos comúnmente aisladas. Los científicos de laboratorio también deben reconocer los aislamientos atípicos de Aspergillus spp. Recientemente se ha informado de la existencia de cepas poco esporulantes (blancas) de A. fumigatus con una menor susceptibilidad a varios fármacos antifúngicos. Estas cepas blancas tienen una secuencia genética diferente a la del tipo salvaje, A. fumigatus Fresenius, y no desarrollaron las típicas cabezas conidiales azul-verde hasta 10-12 días después de la incubación. Otro desafío es el moho blanco, Neosartorya fisheri, que inicialmente produce cabezas conidiales escasas y parecidas a las de A. fumigatus. Sin embargo, N. fisheri desarrolla posteriormente numerosos cleistotecios redondos y de paredes finas, lo que facilita la diferenciación de A. fumigatus. Un microscopio es útil para localizar rápidamente las cabezas de los conidios y los cleistocitos. Pueden aparecer aislados de A. fumigatus estériles, blancos, de crecimiento rápido o glabros, en forma de montículo y de crecimiento lento, que requieren pruebas de termotolerancia y exoantígenos para su identificación definitiva. Khan et al. informaron de un caso atípico de A. terreus aislado de muestras de las vías respiratorias inferiores de un paciente con aspergiloma. Las colonias iniciales eran anaranjadas y producían un pigmento amarillo difusible y pequeñas células individuales que se confundían con los conidios de Scedosporium apiospermum. Los anticuerpos precipitantes y las cabezas conidiales típicas de A. terreus producidas tras 10 semanas de incubación confirmaron la identificación.

Las imágenes y la información disponible en los libros de texto y en Internet ofrecen buenas oportunidades educativas para aprender a identificar Aspergillus spp. La experiencia práctica, sin embargo, sigue siendo la herramienta de enseñanza más eficaz. Los CDC, la Red Nacional de Formación de Laboratorios (NLTN) y el CBS ofrecen talleres de laboratorio. Cuando no es posible viajar fuera de las instalaciones, se anima a los laboratorios a utilizar el tutorial en línea, Aspergillus Reference Cultures , para la formación interna. Los organismos de referencia que se enumeran allí están disponibles para su compra en las principales colecciones de cultivos.

El análisis de cada paso del procedimiento de cultivo puede conducir a una mejor recuperación de aspergilos. Se ha sugerido licuar las muestras con Sputolysin u otros agentes mucolíticos para la recuperación de los hongos atrapados en el moco del esputo y el material de los senos paranasales recuperado de la cirugía endoscópica . El uso de dextrosa de patata, copos de patata, extracto de malta, agar de moho inhibidor o agares de esporulación similares como medios de aislamiento primarios para Aspergillus spp. puede acelerar la tasa de crecimiento y la producción de conidias. La adición de agentes antibacterianos a los medios de aislamiento ayuda a reducir el tiempo de identificación al inhibir el sobrecrecimiento bacteriano y reducir la necesidad de subcultivo. La incubación inicial de los medios para hongos a 35-37°C en lugar de, o además de, 30°C puede acelerar el crecimiento de algunos aspergilli . Del mismo modo, la inspección diaria de los medios de cultivo garantiza una detección lo más temprana posible. Al incubar placas de cultivo en un entorno microaerófilo a 35 °C, Tarrand descubrió que algunos Aspergillus spp. de importancia clínica crecían en 12 de 12 cultivos de caldo. Los cultivos de los mismos organismos incubados a 25 °C sin CO2 no dieron resultados positivos. Sería útil realizar más estudios para aclarar los medios y las condiciones más eficaces para la recuperación y la identificación rápida de los aspergilli clínicamente importantes.

Con un montaje rápido con cinta adhesiva o un montaje con grasa, normalmente se pueden identificar las cabezas conidiales de Aspergillus spp. Sin embargo, puede ser necesario un cultivo en portaobjetos cuando la esporulación es lenta o atípica. El ritmo rápido de la mayoría de los laboratorios hospitalarios dicta el método más fácil, aunque no necesariamente el más refinado, para realizar el cultivo en portaobjetos. El método clásico de cultivo en portaobjetos de Riddell se ha complementado con otras técnicas menos laboriosas. Un método rápido consiste simplemente en introducir un cubreobjetos de 18 × 18 mm en un ángulo de 45 grados en un medio de esporulación, como el agar de escamas de patata. Cuando el moho esporula, el cubreobjetos se retira cuidadosamente del agar y se monta en una gota de azul de lactofenol o lactofucsina en un portaobjetos. Se coloca otra gota sobre el pequeño cubreobjetos antes de completar el montaje con un cubreobjetos de 22 × 22 mm.

Cuestiones relativas a la mano de obra

El diagnóstico rápido de la aspergilosis no sólo depende de una metodología mejorada, sino también de una mano de obra adecuada y bien formada. Las encuestas sobre las prácticas de micología recomiendan encarecidamente una mayor formación . Debe hacerse especial hincapié en la identificación precisa, el examen directo, el uso adecuado de los medios, la relevancia clínica y la rentabilidad. Sin embargo, una dotación de personal inadecuada puede comprometer tanto la formación como la aplicación de procedimientos más relevantes desde el punto de vista clínico. La encuesta de evaluación comparativa de la ASM reveló una escasez continua de personal en algunos laboratorios de microbiología de los Estados Unidos. En parte, la escasez es el resultado de una reducción del 53%-56% en los programas de formación de CLS en los últimos 12 años. El 34% de los profesionales que trabajan actualmente en los laboratorios de microbiología tienen más de 50 años. ¿Habrá trabajadores más jóvenes para sustituirlos cuando se jubilen? Mientras que casi el 80% de las mujeres de la población activa son menores de 30 años, sólo el 10% de las trabajadoras del laboratorio de microbiología tienen menos de 30 años. Estos datos sugieren que la escasez de mano de obra continuará y posiblemente se agravará.

Conclusión

La mejora de los procedimientos de diagnóstico tradicionales y no tradicionales de las micosis exige esfuerzos simultáneos para garantizar una mano de obra adecuada y para mejorar la movilidad de la carrera, el reconocimiento profesional, las oportunidades de formación avanzada, la compensación y otros factores necesarios para estimular el interés por la ciencia del laboratorio.