Aspergillus-lajien laboratoriossa tapahtuva havaitseminen ja tunnistaminen mikroskooppisella havainnoinnilla ja viljelyllä: perinteinen lähestymistapa

Abstract

Molekulaariset ja immunologiset testit lupaavat parempaa ja nopeampaa laboratoriossa tehtävää diagnoosia aspergilloosin diagnosoimiseksi, mutta mikroskooppinen havainnointi ja viljely ovat edelleen yleisesti käytettyjä ja välttämättömiä työkaluja. Menettelytapojen muutoksilla sekä laboratorioalan ammattilaisten riittävällä koulutuksella voidaan lisätä näiden perinteisten välineiden arvoa. Blankophorin tai Calcofluorin käyttö mikroskooppitutkimuksissa, opportunististen sienten morfologisten ominaisuuksien tunnistamisen parantaminen näytteiden värjätyissä preparaateissa, Aspergillus-suvun kasvuvauhdin ja konidioiden tuotannon maksimoiminen viljelyssä ja tavallisten aspergillien epätyypillisten varianttien tunnistaminen voivat parantaa laboratorion panosta nopeaan diagnoosiin. Tutkimusten mukaan laboratorioalan ammattilaisten määrä vähenee, kun terveydenhuollon kysyntä kasvaa. Henkilöstön tehokkaan rekrytoinnin, sitouttamisen ja kouluttamisen on tapahduttava samanaikaisesti teknologian kehityksen kanssa.

Esittely

Traditionaalisia menetelmiä aspergilloosin ja muiden mykoosien diagnosoimiseksi täydennetään molekyyli- ja immunologisilla menetelmillä. Vaikka nukleiinihappopohjaisten testien edut ovat ilmeiset, niiden standardointi ja kliininen hyöty eivät ole vielä täysin toteutuneet . Lisäksi vaikka Aspergillus-antigeenin galaktomannaanin EIA-testi on laajalti saatavilla Yhdysvalloissa, nukleiinihappopohjaisten testien vakiokäyttö kliinisten isolaattien tunnistamiseen näyttää olevan rajallista. Vertailulaboratorioita, jotka tarjoavat aspergillien molekyylitunnistusta, ovat muun muassa Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Georgia, Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Alankomaat, ja yhdysvaltalaiset laboratoriot, jotka on lueteltu Molekyylipatologian yhdistyksen online-testihakemistossa. Vaikka molekyylimenetelmät kehittyvät jatkuvasti ja ovat yhä helpommin saatavilla, mikroskooppi ja viljely ovat edelleen ensisijaisia laboratoriovälineitä aspergillien havaitsemisessa. Vuonna 2003 tehdyssä American Society for Microbiology (ASM) Benchmarking Survey -tutkimuksessa todettiin, että 89 prosenttia mykologisia testejä tekevistä laboratorioista käyttää viljelyä, 16 prosenttia serologiaa ja alle 5 prosenttia molekyylitestejä. Ainoastaan 3 prosenttia raportoineista laboratorioista käyttää mikrobipatogeenien molekyylitestausta ”kotitekoisesti”. Koska mikroskopointiin ja viljelyyn turvaudutaan edelleen, näiden menetelmien diagnostista arvoa on parannettava menettelytapojen muutoksilla ja laboratoriohenkilöstön riittävällä koulutuksella.

Mikroskopointi

Mikroskooppiset menetelmät, kuten märkäkiinnitys, Gram-värjäys ja perinteinen histopatologia, antavat viitteitä, jotka viittaavat Aspergillus spp:n esiintymiseen kudoksessa. Blankofluori tai kalsiumfluor sekoitettuna 10-20 % kaliumhydroksidiin (KOH) värjää sienisolujen soluseinät ja parantaa sienien havaitsemista. Kalsofluori kiteytyy emäksisessä pH:ssa, mutta Blankofluori ei kiteydy, ja sitä voidaan säilyttää käyttöliuoksena jopa vuoden ajan. Fenotyyppiset merkkiaineet, jotka havaitaan histopatologisilla värjäyksillä sekä Gram-värjäyksellä tai märkäkiinnityksillä, antavat arvokasta tietoa kliinisesti tärkeistä sienistä erityisesti silloin, kun viljelyä ei ole saatavilla (taulukko 1). Mikroskooppisten löydösten vahvistaminen viljelyllä on kuitenkin aina toivottavaa ja useimmissa tapauksissa, joissa on kyse opportunistisista homeista, välttämätöntä patogeenin lopullisen tunnistamisen kannalta. Huolimatta visuaalisten vihjeiden olemassaolosta aspergillien tunnistaminen pelkästään mikroskoopilla voi olla harhaanjohtavaa. Schell raportoi Aspergillus niger -sinuiittitapauksesta, jossa A. niger -konidiat sekoitettiin Candida spp. hiivasoluihin ja A. niger -siipien poikkileikkaukset sekoitettiin zygomykeettien leveisiin hyfeoihin. Kliinisen patologin ja laboratoriomykologin, joka rutiininomaisesti tunnistaa filamenttiset sienet viljelystä, välinen kommunikaatio voi parantaa histopatologian diagnostista arvoa.

Morfologisten ominaisuuksien tunnistaminen

Sen vuoksi, että aspergillit ovat luonnossa kaikkialla esiintyviä, ne voivat yleisesti kontaminoida näytteitä ja viljelymedioita. Näin ollen viljelyssä kasvavien Aspergillus spp. merkityksen määrittäminen on usein haasteellista, kun näytteen mikroskooppinen tutkimus on negatiivinen. Brown et al. havaitsivat maksa- ja munuaissiirron saaneista henkilöistä peräisin olevia Aspergillus-isolaatteja koskevassa tutkimuksessaan, että yli kahden pesäkkeen esiintyminen viljelyssä ja infektio useammassa kuin yhdessä paikassa ennustivat merkittävää infektiota. Akuuttia leukemiaa sairastavilla granulosytopeenisilla potilailla yksittäistä eristystä alempien hengitysteiden näytteestä on pidettävä merkittävänä. Laboratoriohavaintojen yksiselitteinen raportointi lääkärille voi vähentää diagnostista pulmaa. Esimerkiksi lausunto ”Yhteensä kolme Aspergillus fumigatus -pesäkettä eristetty kahdelta kolmesta levystä” antaa enemmän tietoa kuin ”Harvoja A. fumigatus -pesäkkeitä eristetty”.

Viljelytulosten optimointi

Yleisten kliinisten Aspergillus spp. isolaattien eristäminen viljelyssä ja fenotyyppinen tunnistaminen on tavallisesti nopeaa ja helppoa. Viljelyä kuvataan kuitenkin usein hitaaksi, mikä ehkä luo virheellisiä käsityksiä sen arvosta aspergillien osoittamisessa. A. fumigatus kasvaa nopeasti. Tyypilliset velutiinipitoiset, harmaansinivihreät pesäkkeet ja yksiseriöiset konidiivipäät kehittyvät 24-48 tunnissa sekä sienialustoilla että bakteeriviljelyyn yleisesti käytetyllä lampaanveriagarilla. Muiden invasiiviseen aspergilloosiin liittyvien aspergillien, erityisesti A. flavus, A. niger, A. nidulans ja A. terreus, kasvuvauhti on samankaltainen kuin A. fumigatuksella, kun pesäkkeitä mitattiin mallasuuteagarilla ja Czapek-hiiva-agarilla sen jälkeen, kun pesäkkeitä oli inkuboitu seitsemän vuorokautta sekä 25 °C:ssa että 37 °C:ssa. Koska joidenkin Aspergillus-suvun lajien lääkeresistenssi on uhka, A. fumigatus -lajin lisäksi myös harvemmin eristettyjen lajien täydellinen tunnistaminen on perusteltua. Laboratoriotutkijoiden on myös tunnistettava epätyypilliset Aspergillus spp:n isolaatit. Äskettäin raportoitiin huonosti sporuloivista (valkoisista) A. fumigatus -kannoista, joiden herkkyys useille sienilääkkeille on vähentynyt. Näiden valkoisten kantojen geneettinen sekvenssi eroaa villityypin A. fumigatus Freseniuksen geneettisestä sekvenssistä, eivätkä ne kehittäneet tyypillisiä sinivihreitä konidiaalipäitä ennen kuin 10-12 päivää inkubaation jälkeen. Toinen haaste on valkoinen home, Neosartorya fisheri, joka tuottaa aluksi harvoja, A. fumigatus -bakteeria muistuttavia konidiapäitä. Myöhemmin N. fisheri kehittää kuitenkin lukuisia pyöreitä, ohutseinäisiä kleistotelekkeitä, jolloin erottaminen A. fumigatusista on helppoa. Leikkausskooppi on kätevä konidien päiden ja kleistoteesien nopeaan paikantamiseen. A. fumigatusin steriilejä, valkoisia, nopeasti kasvavia tai kaljuuntuneita, kumpuilevia, hitaasti kasvavia isolaatteja voi esiintyä, ja niiden lopullinen tunnistaminen edellyttää termotoleranssin ja eksoantigeenin testausta. Khan et al. raportoivat epätyypillisen A. terreus, joka on eristetty aspergilloomapotilaan alempien hengitysteiden näytteistä. Alkuperäiset pesäkkeet olivat oransseja ja tuottivat diffuusia keltaista pigmenttiä ja pieniä, yksittäisiä soluja, jotka sekoitettiin Scedosporium apiospermum -bakteerin konidioihin. Saostuvat vasta-aineet ja 10 viikon inkubaation jälkeen tuotetut A. terreuksen tyypilliset konidionpäät vahvistivat tunnistuksen.

Oppikirjoissa ja Internetissä olevat kuvat ja tiedot tarjoavat hienoja opetusmahdollisuuksia Aspergillus spp:n tunnistamisen oppimiseen. Käsituntemus on kuitenkin edelleen tehokkain opetusväline. CDC, National Laboratory Training Network (NLTN) ja CBS tarjoavat laboratoriotyöpajoja. Jos matkustaminen muualle ei ole käytännöllistä, laboratorioita kannustetaan käyttämään sisäistä koulutusta varten verkko-opetusohjelmaa Aspergillus Reference Cultures (Aspergillus-viiteviljelmät). Siellä luetellut viiteorganismit ovat ostettavissa suurimmista viljelmäkokoelmista.

Viljelymenetelmän jokaisen vaiheen analysointi voi parantaa aspergillien talteenottoa. Näytteiden nesteyttämistä sputolysiinillä tai muilla limakalvoihin vaikuttavilla aineilla on ehdotettu endoskooppisessa kirurgiassa talteen otettujen sienien talteen saamiseksi ysköksen ja poskionteloiden limakalvoihin jääneestä materiaalista. Perunadekstroosin, perunahiutaleen, mallasuutteen, inhiboivan homeagarin tai vastaavien sporulaatioagarien käyttö Aspergillus spp:n ensisijaisina eristysmedioina voi nopeuttaa kasvunopeutta ja konidioiden tuotantoa. Antibakteeristen aineiden lisääminen eristysmedioihin auttaa lyhentämään tunnistamiseen kuluvaa aikaa estämällä bakteerien liikakasvua ja vähentämällä subkulttuurin tarvetta. Sienialustojen inkubointi aluksi 35-37 °C:ssa 30 °C:n sijasta tai sen lisäksi voi nopeuttaa joidenkin aspergillien kasvua. Vastaavasti viljelmien päivittäisellä tarkastuksella varmistetaan mahdollisimman varhainen havaitseminen. Inkuboimalla viljelylevyjä mikroaerofiilisessä ympäristössä 35 °C:ssa Tarrand havaitsi, että valitut, kliinisesti tärkeät Aspergillus spp. kasvoivat 12 liemiviljelmästä 12:sta. Samojen organismien viljelmät, joita inkuboitiin 25 °C:ssa ilman hiilidioksidia, eivät tuottaneet positiivisia tuloksia. Lisätutkimukset olisivat hyödyllisiä kliinisesti tärkeiden aspergillien talteenoton ja nopean tunnistamisen kannalta tehokkaimpien elatusalustojen ja olosuhteiden selvittämiseksi.

Aspergillus spp:n konidiapäät voidaan tyypillisesti tunnistaa nopealla Scotch-nauhalla tai tease mountilla. Liuskaviljely voi kuitenkin olla tarpeen, jos sporulaatio on hidasta tai epätyypillistä. Useimpien sairaalalaboratorioiden nopea työskentelytahti edellyttää helpointa, vaikkakaan ei välttämättä hienostuneinta, menetelmää objektiviljelyn suorittamiseksi. Riddellin klassista liukuviljelymenetelmää on täydennetty muilla, vähemmän työvoimavaltaisilla tekniikoilla. Nopea menetelmä on yksinkertaisesti työntää 18 × 18 mm:n suuruinen peitelevy 45 asteen kulmassa itämisaineeseen, kuten perunahiutaleagariin. Kun home sporuloi, peitinlippa vedetään varovasti pois agarista ja kiinnitetään mikroskooppilasille tippaan lakto-fenolisinistä tai laktofuksiinia. Toinen pisara asetetaan pienen peitinlasin päälle, ennen kuin kokoonpano viimeistellään 22 × 22 mm:n peitinlasilla.

Työvoimakysymykset

Aspergilloosin nopea diagnosointi edellyttää paitsi parempia menetelmiä myös riittävää ja hyvin koulutettua työvoimaa. Mykologiakäytäntöjä koskevissa tutkimuksissa suositellaan vahvasti koulutuksen lisäämistä . Erityistä huomiota olisi kiinnitettävä tarkkaan tunnistamiseen, suoraan tutkimiseen, elatusaineiden asianmukaiseen käyttöön, kliiniseen merkitykseen ja kustannustehokkuuteen. Riittämätön henkilöstö voi kuitenkin vaarantaa sekä koulutuksen että kliinisesti merkityksellisempien menettelyjen toteuttamisen. ASM:n vertailuanalyysitutkimus osoitti, että joissakin Yhdysvaltojen mikrobiologian laboratorioissa on edelleen pulaa työvoimasta. Pula johtuu osittain siitä, että CLS-koulutusohjelmat ovat vähentyneet 53-56 prosenttia viimeisten 12 vuoden aikana. Mikrobiologian laboratorioissa työskentelevistä ammattilaisista 34 prosenttia on nykyisin yli 50-vuotiaita. Löytyykö heidän tilalleen nuorempia työntekijöitä, kun he jäävät eläkkeelle? Vaikka lähes 80 prosenttia työvoiman naisista on alle 30-vuotiaita, vain 10 prosenttia mikrobiologian laboratorion naispuolisista työntekijöistä on alle 30-vuotiaita . Nämä tiedot viittaavat siihen, että työvoimapula jatkuu ja mahdollisesti pahenee.

Johtopäätökset

Mykoosien perinteisten ja ei-perinteisten diagnosointimenetelmien parantaminen edellyttää samanaikaisia ponnisteluja työvoiman riittävyyden turvaamiseksi ja uraliikkuvuuden, ammatillisen tunnustuksen, täydennyskoulutusmahdollisuuksien, palkkauksen ja muiden sellaisten tekijöiden parantamiseksi, joita tarvitaan kiinnostuksen herättämiseksi laboratoriotieteitä kohtaan.