AI-1-signaalilla ohjataan solujen kasvuvauhtia
Testasimme aluksi E. coli -solujen kasvuvauhdin kontrolloimista sokerin kuljettamiseen osallistuvan geenin ptsH:n transkriptionaalisen säätelyn avulla. HPr (jota ptsH koodaa) on laajalti tunnustettu yhdeksi useista proteiineista (esim. E1, HPr, EII), jotka peräkkäin siirtävät fosforyyliryhmän fosfoenolipyruvaatista (PEP) glukoosiin (tai muuhun PTS-hiilihydraattiin)34. HPr on erittäin konservoitunut37. Hiljattain havaittiin, että HPr on vuorovaikutuksessa AI-2-kinaasi LsrK:n kanssa ja vaikuttaa AI-2:n ottoon35. Hyödynsimme AI-2:ta moduloivaa toimintoa myöhemmin, kun rakensimme AI-2-tunnistussolun. Tässä osoitimme, että ptsH-mutanttikannat kasvavat hitaammin kuin villityyppikannat glukoosia sisältävässä minimaalisessa väliaineessa (täydentävä kuva 1a). Kun ptsH sijoitettiin IPTG-indusoituvan promoottorin alle ptsH-mutantissa, kasvunopeutta voitiin kontrolloida IPTG:n lisäämisen perusteella (Täydentävä kuva 1b). Tärkeää on, että osoitimme, että ptsH:n ilmentymisen indusointi johtaa solujen kasvunopeuden lisääntymiseen. Yhtä tärkeää on, että tämä käyttäytyminen on riippumaton siitä, sisältääkö väliaine glukoosia pääasiallisena hiililähteenä vai ei (Täydentävä kuva 1c).
Tämän konseptin todisteen perusteella suunnittelimme seuraavaksi QS-signaalilla ohjatun kasvunopeuden. Ohjauskannan rakentamiseksi ptsH asetettiin AI-1 lasI QS-promoottorin AI-1 lasI QS-promoottorin ohjaamana plasmidiin pAHL-HPr (kuva 2a) ptsH-mutantti-kannassa PH04. Muualla plasmidissa sekä dsRedExpress2 solun visualisointia varten että LasR, jota tarvitaan lasI-promoottorin aktivointiin, ilmentyivät konstitutiivisen T5-promoottorin alla. AI-1:n lisääminen ohjauskantaan lisäsi solujen kasvunopeutta jopa 1,8-kertaiseksi lähtötilanteen kasvunopeuteen nähden annosriippuvaisesti (kuva 2b). Mitattu spesifinen kasvunopeus (1 ja 4 tunnin välillä AI-1:n lisäämisestä) toimi perustana AI-1-tasoon perustuvalle Monod-tyyppiselle kasvunopeuden mallille (kuva 2c).
AI-1:n kvorum sensing -signaali kontrolloi kasvunopeutta HPr:n ilmentymisen kautta. a Kaavio AI-1:n kasvuun reagoivista kontrollisoluista (PH04 pAHL-HPr). AI-1 sitoo LasR:ää (konstitutiivisesti ilmentynyt) ja aktivoi las-promoottorin, mikä johtaa HPr:n ilmentymiseen, mikä lisää solujen kasvunopeutta. b Eri AI-1-pitoisuuksilla kasvatettujen PH04 pAHL-HPr-viljelmien kasvukäyrät. Viljelmät kasvatettiin OD 0,15:een (t = 0) ja AI-1:tä lisättiin 40 minuutin kuluttua (merkitty nuolella). Taulukossa esitetään keskimääräinen kasvunopeus 1-4 tuntia AI-1:n lisäyksen jälkeen. c Kasvunopeus suhteessa peruskasvunopeuteen (joko 0,28 tai 0,32 h-1) eri AI-1-pitoisuuksilla on piirretty kahdesta erillisestä kokeesta (keltaiset ja oranssit pisteet). Piirretään funktio fHPr, joka kuvaa suhteellista kasvunopeutta AI-1:n funktiona (sininen viiva). A = 1, B = 1, C = 29, D = 2,1, E = 0,48. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona
AI-1 moduloi koostumusta ohjainsolujen yhteiskulttuureissa
AI-1-säädeltyjä ohjainsoluja viljeltiin tämän jälkeen yhteiskulttuureissa muiden kantojen kanssa, jotta voitiin varmistaa, että AI-1:n lisääminen muutti yhteiskulttuurin koostumusta. Punaista fluoresoivaa proteiinia ilmentäviä kasvunohjainsoluja (PH04 pAHL-ptsH) viljeltiin yhdessä joko PH04 pCT6:n tai TOP10 pT5G7:n kanssa. PH04 pCT6:n peruskasvunopeus on samanlainen kuin PH04 pAHL-ptsH:n, kun taas TOP10 pT5G kasvaa huomattavasti nopeammin. Viljelmät inokuloitiin suunnilleen samoilla solutiheyksillä ja täydennettiin vaihtelevilla AI-1-pitoisuuksilla. Näytteet otettiin 8 tunnin kuluttua analysoitavaksi fluoresenssimikroskopialla ja kvantifioitiin ImageJ:llä. Odotetusti, kun kontrollisoluja viljeltiin PH04:n kanssa, kontrollisolujen viljelykoostumus kasvoi AI-1-pitoisuuden kasvaessa (kuva 3a). Samanlainen suuntaus havaittiin, kun soluja viljeltiin TOP10:llä, vaikka TOP10:n kasvuvauhti oli nopeampi (kuva 3b). Toisin sanoen rinnakkaiskulttuureissa ilman AI-1:tä kontrollisolujen osuus TOP10:n rinnakkaiskulttuureissa itse asiassa laski merkittävästi alkuperäisestä ~0,5:stä ~0,09:ään seuraavien 8 tunnin aikana. AI-1:n lisääminen kumosi tämän kasvunopeuseron ja johti korkeampaan kontrollisolujen määrään saman 8 tunnin jakson aikana. Nämä tulokset osoittavat, että riippumatta viljelyssä olevista muista kannoista ja niiden kasvuvauhdista AI-1 (joka ei ole E. coli QS-signaalimolekyyli) moduloi muokatun kontrollerikannan kasvuvauhtia, ja muutos tapahtui riittävän nopeasti, jotta viljelykoostumuksen koostumus muuttui havaittavasti – jopa suhteellisen lyhytaikaisissa eräkasvatusolosuhteissa (toisin kuin syöttöeräkasvatuksessa, toistuvassa eräkasvatuksessa tai jatkuvassa viljelyssä).
AI-1 säätelee solujen kasvunopeutta yhteiskulttuureissa. a PH04 pAHL-HPr (lyhennettynä HPr), jota on viljelty yhdessä PH04 pCT6:n (lyhennettynä PH04) kanssa. Kumpaankin kulttuuriin inokuloitiin 0,5 %, jolloin HPr:n alkufraktio oli ~0,5. Ilmoitettu AI-1-taso lisättiin inokulaation aikana. Näytteet kerättiin yhteiskulttuurin koostumuksen analysointia varten 8 tunnin kuluttua. Virhepalkit edustavat teknisten nelinkertaisten näytteiden s.d. b PH04 pAHL-HPr (lyhennettynä HPr) yhteiskulttuurissa TOP10 pT5G:n (lyhennettynä TOP10) kanssa. Jokaista viljelmää inokuloitiin 0,5 %, jotta HPr:n alkuperäinen HPr-fraktio olisi ~0,5. Ilmoitettu AI-1-taso lisättiin inokulaation aikana. Näytteet kerättiin yhteiskulttuurin koostumuksen analysointia varten 8 tunnin kuluttua. Virhepalkit edustavat teknisten triplukoiden s.d. c PH04 pAHL-HPr (lyhennettynä HPr) yhteiskulttuurissa PH04 pSox-LasI:n kanssa 1 µM:n PYO-induktiolla tai ilman sitä. Alkuperäinen HPr-fraktio yhteiskulttuurissa oli ~0,5. Näytteet kerättiin AI-1-mittausta varten 2 h ja 4 h kuluttua ja yhteiskulttuurin koostumuksen analysointia varten 5 h kuluttua. Virhepalkit edustavat biologisten kaksoiskappaleiden s.d.:tä. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona
Seuraavaksi AI-1-säädeltyä ohjainkantaa viljeltiin yhdessä solujen kanssa, jotka tuottavat AI-1:tä indusoituna. PH04 pSox-LasI ja PH04 pAHL-HPr viljeltiin yhdessä. Plasmidi pSox-LasI sisältää lasI:n, joka syntetisoi AI-1:tä, pyosyaniini-indusoituvan soxS-promoottorin alla7. Tässä kokeessa kontrollerikanta saa signaalin translaattorikannalta, joka puolestaan tuotti AI-1:tä vasteena pyosyaniinille. Tällä tavoin osoitetaan, että yhteenkasvatuksen ohjausjärjestelmä reagoi tiettyyn molekulaariseen vihjeeseen. Kumpikin viljelmä inokuloitiin suunnilleen samoilla lähtötiheyksillä, ja yhteisviljelmät joko altistettiin pyosyaniinille tai ei. Altistetut viljelmät osoittivat lisääntynyttä AI-1:n tuotantoa ja vastaavasti lisääntynyttä PH04 pAHL-HPr:n koostumusta 5 tunnin kuluessa (kuva 3c). Nämä tulokset osoittavat, että vaihtoehtoisesta kannasta tuotettu AI-1 voi muuttaa ohjauskannan kasvunopeutta ja että tämä voi tapahtua ajassa, joka on tarpeen muutoksen aikaansaamiseksi panosprosessissa. Lisäksi tämä osoittaa, että käyttäjän säätelemä rinnakkaiskulttuuri on mahdollisesti toteutettavissa molekyylin tai induktorin, tässä tapauksessa pyosyaniinin, käyttäjäkohtaisen käytön perusteella. Seuraavaksi muokkasimme kääntäjäkannan luomaan autonomisesti säädellyn yhteiskulttuurin, joka perustuu läpitunkevaan AI-2-signaalimolekyyliin.
AI-2:ta aistivien kääntäjäsolujen suunnittelu
Konstruoidaksemme solulinjoja, jotka aistivat AI-2:n ja tuottavat AI-1:tä, muokkasimme kantoja, jotka aktivoivat AI-1:tä syntetisoivan LasI:n ilmentymisen, kun AI-2:n lsr-promoottori aktivoidaan. Käytimme kahden plasmidin järjestelmää monistamaan ekspressiota heikosta lsr-promoottorista25 (kuva 4a). Lyhyesti sanottuna LsrK fosforyloi AI-2:n, ja fosforyloitu AI-2 vapauttaa promoottorin LsrR:n aiheuttaman repression, mikä lisää lsr-kuljettajageenien transkriptiota ja kiihdyttää AI-2:n imeytymistä. Samalla lsr-promoottorin AI-2-välitteinen aktivoituminen johtaa T7 RNA-polymeraasin transkriptioon plasmidista pCT6 ja sitä seuraavaan lasI:n transkriptioon plasmidista pET-LasI.
Kehitetyt kääntäjäsolut tuottavat AI-1:tä vasteena AI-2:lle. a Kääntäjäsolut kytkevät AI-2:n ja AI-1:n kvorum sensing -piirit toisiinsa käyttämällä kaksoisplasmidijärjestelmää. Fosforyloitunut AI-2 aktivoi T7 RNA-polymeraasin ilmentymisen ja sitä seuraavan LasI:n ilmentymisen, joka syntetisoi AI-1:n. b AI-1:tä tuottavat CT104 pCT6 pLasI tai PH04 pCT6 pLasI, joita kasvatetaan eri väliaineissa AI-2:n lisäyksen kanssa ja ilman sitä. AI-2 lisättiin ilmoitetulla tavalla ~OD 0,1:n kohdalla ja näytteet AI-1:n mittausta varten otettiin 6 tuntia myöhemmin. Virhepalkit edustavat teknisten kaksoiskappaleiden välistä s.d.:tä. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona
Systeemi rakennettiin ensin E. coli -isäntäkannassa CT104, joka on luxS-mutantti (esim. kyvytön tuottamaan AI-2:ta). CT104:stä puuttuu myös lsrFG, joka vastaa fosforyloituneen AI-2-signaalin hajottamisesta, mikä lisää solun herkkyyttä AI-238:lle. Varmistimme, että tämä solulinja, CT104 pCT6 pET-LasI, tuotti AI-1:tä, kun sitä viljeltiin AI-2:ta tuottavan BL21:n ilmastoidussa mediassa (CM) (lisäyskuva 2). BL21:tä kasvatettiin eri solutiheyksiin, CM kerättiin ja CT104-soluja kasvatettiin kerätyssä CM:ssä. Tärkeää oli, että CT104-solujen tuottama AI-1 korreloi AI-2:ta tuottavien BL21-solujen tiheyden kanssa (täydentävä kuva 2a). Testasimme myös, voivatko AI-2:ta tuottavien solujen vaihtelevia osuuksia sisältäviin konsortioihin lisätyt kääntäjäsolut tuottaa AI-1-signaalia konsortion koostumuksen perusteella. CT104-soluja lisättiin viljelmiin, joissa oli vaihteleva suhde BL21 (luxS+) ja BL21 ΔluxS. Kuuden tunnin kuluttua AI-1-signaalin taso solunulkoisessa väliaineessa osoitti viljelmän koostumuksen, joka puolestaan perustuu ensisijaisesti luxS+-solujen alkuperäiseen fraktioon25 (Täydentävä kuva 2b).
Edellä kuvatut kokeet osoittivat, että AI-2:ta tuottavista soluista voitiin rakentaa solulinja, joka tuottaa AI-1:tä AI-2:n vasteena. Nämä kokeet tehtiin LB-mediassa eikä glukoosia sisältävässä mediassa. Glukoosin läsnäolo estää AI-2:n ottoa ja lsr-promoottorin aktiivisuutta39 , ja CT104-solujen käyttö voitaisiin mahdollisesti rajoittaa väliaineisiin, joissa ei ole glukoosia (ks. lisäyskuva 3 AI-2 QS-reitin kaavio). AI-2 QS-järjestelmää koskevan tietämyksen perusteella yritimme kehittää kannan, joka kykeni ottamaan AI-2:ta ja aktivoimaan lsr-promoottoria glukoosia sisältävässä väliaineessa. Tällä tavoin tuloksiamme voitaisiin soveltaa yleisemmin. Aiemmin osoitimme, että HPr (jota koodaa ptsH) on vuorovaikutuksessa LsrK:n kanssa, mikä estää LsrK:n kinaasiaktiivisuutta, ja että ptsH-mutanttien on osoitettu ottavan AI-2:ta myös glukoosia sisältävässä väliaineessa35. Näin ollen oletimme, että PH04:n (ΔptsH ΔluxS) käyttö isäntäkantana mahdollistaisi AI-2:een perustuvan AI-1:n tuotannon glukoosia sisältävissä väliaineissa. Testasimme kääntäjäsoluja käyttämällä molempia isäntäkantoja LB- ja M9-glukoosialustoissa AI-2:n kanssa ja ilman sitä. Tuotetun AI-1:n määrä riippui AI-2:n lisäyksestä, mutta myös isäntäkannasta ja väliaineesta (kuva 4b). Molemmat kannat tuottivat AI-1:tä, kun soluja lisättiin LB-mediaan, jossa oli AI-2. Odotetusti M9-mediassa CT104-isäntäkannan käyttäminen johti pieneen tai merkityksettömään kertaiseen muutokseen AI-1-aktiivisuudessa verrattaessa viljelmiä AI-2:n kanssa ja ilman AI-2:ta. Tärkeää on kuitenkin se, että PH04-kääntäjän solut osoittivat AI-2:n aktivoimaa AI-1:n tuotantoa M9 + glukoosi -mediassa. Näin muokattua järjestelmää voitiin käyttää glukoosia sisältävissä väliaineissa.
PH04-kääntäjäsolujen karakterisointi
PH04-kääntäjäsolut ottavat AI-2-signaalimolekyylin, välittävät signaalin aktivoimalla LasI:n ilmentymisen ja syntetisoivat ja erittävät AI-1:tä. Haluttu AI-1-tuotos on tällöin riippuvainen AI-2-syötteestä. Me karakterisoimme AI-2:n signaloimaa AI-1:n tuotantoa PH04-kääntäjäkannassa ajan kuluessa ja biologisesti merkityksellisillä AI-2-pitoisuuksilla. PH04-kääntäjäsolujen AI-1-tuotantonopeuden havaittiin olevan annosriippuvainen AI-2:sta (kuva 5a). Huomaamme, että näissä ja vastaavissa olosuhteissa AI-2 kuluu suurimmaksi osaksi 4 tunnin kuluessa (kuva 5b). AI-2:n tai AI-2:een perustuvan AI-1:n tuotannon lisääminen näissä eräviljelmissä ei johtanut havaittavaan solujen kasvun vähenemiseen (kuva 5c). Tämän jälkeen luonnehdimme AI-1:n tuotantonopeutta solua kohden ajan mittaan jokaisella testatulla AI-2-pitoisuudella piirtämällä logistisen funktion AI-1-tietojen kautta, määrittämällä tämän yhtälön derivaatan ajan mittaan ja jakamalla derivaatta ajan mittaan vallitsevalla solutiheydellä (lisätaulukko 1), jolloin saatiin aikaan ajasta riippuvainen spesifinen tuotantonopeus. Tuloksena saadut kuvaajat (kuva 5d) osoittavat AI-1:n arvioidun solukohtaisen tuotantonopeuden lisätyn AI-2:n ja AI-2:n lisäyksestä kuluneen ajan funktiona. Kuten myöhemmin osoitetaan, tämä on linjassa sen taustalla olevan havainnon kanssa, jonka olemme havainneet siitä, että geeniekspression kehityskaari vasteena alkuperäiseen vihjeeseen on melko vankka21,38,40.
Kuva 5
AI-1-tuotannon karakterisoiminen kääntäjänsalpaajakennosoluissa. PH04-kääntäjäsoluja viljellään M9-glukoosimediassa, jossa on vaihtelevia AI-2-pitoisuuksia. Solut inokuloitiin yön yli -viljelmistä ja AI-2 lisättiin ilmoitetulla tavalla t = 0. a Solunulkoiset AI-1-pitoisuudet ajan funktiona. Virhepalkit edustavat teknisten kaksoiskappaleiden s.d. b Solunulkoinen AI-2 aktiivisuus ajan funktiona. Virhepalkit edustavat teknisten kaksoiskappaleiden s.d. c Solutiheys ajan funktiona. d AI-1:n tuotantonopeuden fAI1 funktiot eri AI-2-pitoisuuksille (yhtenäiset viivat) ja AI-1:n tuotantonopeudet, jotka on laskettu kokeellisten tietojen perusteella (pisteet). Lähdetiedot esitetään Source Data -tiedostona
Seuraavaksi testattiin PH04-kääntäjäsolujen tuottaman AI-1:n vaikutusta AI-1:een reagoivien ohjainsolujen kasvunopeuteen. Toisin sanoen kasvuun reagoivia soluja lisättiin CM:ään, joka sisälsi AI-1:tä, joka oli peräisin kääntäjäsoluista, jotka oli altistettu vaihteleville AI-2-pitoisuuksille, ja niitä viljeltiin ~3 h (täydentävä kuva 4a). Sen lisäksi, mitä näytettiin kuvassa 5, jossa AI-1 syntyy suorasta altistumisesta AI-2:lle, tämä koe osoittaa, että solujen kääntäminen AI-2:sta AI-1:ksi voidaan tehdä tarvittavalla ekspressiolla ja soluviljelydynamiikalla siten, että vaikutetaan toisen populaation kasvunopeuteen (Täydentävä kuva 4b). Huomaamme myös, että kontrollisolujen dynaamisen kasvunopeuden osoitettiin pienenevän ajan kuluessa seuraavien 3 h aikana. Tämä havainto tehtiin dramaattisemmin myöhemmissä yhteiskulttuurikokeissa.
Ko-kulttuurin koostumuksen itsenäinen säätely
Lisäsimme seuraavaksi kääntäjän soluja (joihin viitataan nimellä Populaatio A) ja AI-1:een reagoivia kontrollisoluja (Populaatio B) liuoksiin, joissa oli erilaisia AI-2:n alkupitoisuuksia. Kääntäjäsolujen ja ohjainsolujen yhteiskulttuureissa kääntäjäsolut säätelevät itsenäisesti konsortioiden koostumusta alkuperäisen AI-2-tason perusteella. Täydentävässä kuvassa 5 esitetyissä yhteiskulttuureissa, joissa AI-2:n lähtötasoa nostettiin, AI-1:n määrä lisääntyi (täydentävä kuva 5b) ja populaation B suhteellinen runsaus kasvoi vastaavasti (täydentävä kuva 5a). Nämä tulokset osoittivat konsortiopopulaatioiden signaalivälitteisen autonomisen kontrollin käsitteen. Tärkeää on, että Populaatio A:n ja Populaatio B:n kasvunopeuden arviot vastasivat odotettuja kasvunopeusarvoja, jotka mitattiin monokulttuurikokeiden aikana (Täydentävä kuva 5c).
Sitten, kun olimme osoittaneet, että kääntäjän solut voivat säädellä konsortioiden koostumusta AI-2:lle altistumisen perusteella, kehitimme matemaattisen mallin järjestelmän dynamiikan kuvaamiseksi. Tällä tavoin voidaan ennustaa yhteiskulttuurin käyttäytymistä, kun otetaan huomioon tietyt alkuolosuhteet, kasvunopeuden mallit jne., jotta voidaan määrittää parametrit, joita tarvitaan halutun tuotoksen kohdistamiseksi. Tämä käsitteellisesti yksinkertainen matemaattinen malli luotiin ennustamaan yhteiskulttuurin käyttäytymistä yksittäisistä kannoista saatujen tietojen avulla. Malli koostuu neljästä tavallisesta differentiaaliyhtälöstä, joista yksi kullekin populaatiotiheydelle, substraattipitoisuudelle ja AI-1-pitoisuudelle (lisätaulukot 2 ja 3). Solujen kasvun ja substraattikonsentraation mallintamiseen käytettiin Monodin kasvukinetiikkaa, jossa on vakioitu tuottokerroin, ja lisäfunktioita, jotka ottavat huomioon QS-molekyylien tuotannon ja/tai vaikutukset. Populaation A tuottama AI-1 perustuu sekä AI-2 -altistuksen tasoon että aikaan (fAI1). Aiemmassa työssä38 havaitsimme, että solujen käyttäytymisen ajasta riippuvat liikeradat olivat seurausta alkuperäisestä altistumisesta autoinduktorille, joten AI-1:n tuotannon ajasta riippuvat funktiot olisivat tässä uskottavia. Populaation B kasvunopeus muotoiltiin AI-1:n vallitsevan tason (fHPr) perusteella. Suurimmat spesifiset kasvunopeudet mitattiin kokeellisten tietojen perusteella, tuotokset arvioitiin kokeellisesti havaitun stationaarivaiheen tiheyden ja tunnettujen alkusubstraattipitoisuuksien perusteella, ja K1- ja K2-arvot valittiin glukoosia koskevien kirjallisuusarvojen perusteella. ODE-järjestelmän ratkaisemiseen käytettiin MATLABin (versio R2016a) ode45-ratkaisinta. Mallia voidaan käyttää osoittamaan, miten yhteiskulttuuripopulaation ennustetaan muuttuvan ajan myötä, kun otetaan huomioon nämä yksinkertaiset fenomenologiset nopeusyhtälöt ja parhaiten sopivat vakiot. Kuten todettiin, tämä tarjoaa perustan sen määrittämiselle, voidaanko rinnakkaiskulttuurin edes ennustaa kehittyvän eräkasvatuksessa käytettävissä olevien rajallisten aikojen aikana. Tärkeää on, että monokulttuureista saamiamme tuloksia käytetään simuloimaan koekulttuureista saatuja kokeellisia tuloksia.
Seuraavaksi arvioimme autonomisesti ohjelmoitua koekulttuurin ohjausta malliennusteiden avulla. Populaatioiden A ja B yhteiskulttuurit sijoitettiin yhteen erilaisten alkusolupopulaatioiden osalta ja lisättiin sitten väliaineeseen, jossa oli määrättyjä AI-2-pitoisuuksia, jotta populaatiorata saataisiin liikkeelle. Järjestelmässämme alkuperäinen koostumus valitaan yhteiskulttuuriin syötettyjen solujen suhteen perusteella, minkä jälkeen kulttuurin koostumusta säädetään ajan mittaan itsenäisesti väliaineen AI-2-tason perusteella. Vertailimme tuloksia malliimme. Kuvassa 6 on esitetty yhteiskulttuurin koostumus ja AI-1-taso 5 tunnin kuluttua erilaisissa olosuhteissa, mukaan lukien vaihtelevat alkuperäiset A:B-suhteet ja AI-2-taso. Näissä testeissä käytimme yhtä alkupopulaation solutiheyttä. Tärkeää on, että havaitsimme mallimme ennustavan hyvin kokeellisia tuloksia sekä AI-1-tason että yhteiskulttuurin koostumuksen osalta. Toteamme myös, että mallia voidaan käyttää sellaisten alkuolosuhteiden valitsemiseen, jotka antavat halutun tuloksen. Esimerkiksi jos tavoitteena on populaatio B, jonka suhteellinen solutiheys on 55 % 5 tunnin kuluttua, yhteiskulttuuri voitaisiin aloittaa alkuvaiheessa A:B-suhteella 60:40 ja AI-2-pitoisuudella 40 µM. Muita skenaarioita testattiin ja validoitiin kuvan mukaisesti. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että solukoostumuksen alkutilanne (esim. A:B-suhde) ja altistuminen eri AI-2-pitoisuuksille vaikuttavat molemmat yhteisviljelypopulaation kehityskulkuun. Yhtä tärkeää on kuitenkin se, että ortogonaalinen signaalimolekyyli AI-1 käyttäytyi mallinnetulla tavalla. Odotamme, että tämän ja muiden kääntäjäsignaalien mukaan ottaminen mahdollistaa jatkossa uusien, vaihtelevien tai monimutkaisempien konsortioiden suunnittelun ja/tai hallinnan.
Ko-kulttuurin käyttäytymisen ennustaminen matemaattisen mallin avulla. A:n ja B:n yhteiskulttuurit lisättiin väliaineeseen, joka sisälsi vaihtelevia AI-2-pitoisuuksia, ja näytteet AI-1:n (vasemmalla) ja yhteiskulttuurin koostumuksen (oikealla) mittausta varten kerättiin 5 h kuluttua. Molemmat solulinjat inokuloitiin yön yli -viljelmistä yhdistettyyn alkuperäiseen OD-arvoon 0,05. Alkuperäinen A:B-suhde on merkitty. Kontrollissa ”C” käytettiin PH04 pAHL-sfGFP:tä PH04 pAHL-HPr:n sijasta kuten populaatiossa B ja käytettiin mediaa, jossa oli 0 µM AI-2. Sekä mallitulokset että kokeelliset tulokset on esitetty. Virhepalkit edustavat teknisten kaksoiskappaleiden (AI-1-mittaukset) ja teknisten neloiskappaleiden (koostumusmittaukset) välistä s.d.:tä. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona
Testasimme yhteiskulttuurin ohjainjärjestelmää altistamalla AI-2-pitoisuudelle, 80 µM, joka oli korkeampi kuin AI-2-pitoisuudet, joita käytimme kääntäjäsolujen karakterisoimiseksi ja joille meillä ei ollut mallia. Käytimme yhteiskulttuurin tuloksia (kuva 6) arvioidaksemme kääntäjäsolujen käyttäytymistä monokulttuurissa tällä AI-2-pitoisuudella. Tämän jälkeen teimme monokulttuurikokeita lisäämällä 80 µM AI-2:ta translaattorisoluihin ja osoitimme, että pystyimme ennustamaan monokulttuurin käyttäytymisen yhteiskulttuurin tietojen ja mallin avulla. Täydentävässä kuvassa 6a on esitetty AI-1:n tuotantonopeus, joka ennustettiin yhteiskulttuuriaineiston ja mallin avulla (viiva), ja todellinen AI-1:n tuotantonopeus monokulttuurikokeen aikana (datapisteet). Täydentävässä kuvassa 6b esitetään ennustetut AI-1-tasot monokulttuurissa ajan kuluessa verrattuna todellisiin mitattuihin AI-1-tasoihin. Ennustettu AI-1-taso määritettiin mallin avulla syöttämällä arvioitu AI-1-tuotantonopeus ja monokulttuurin alkuperäinen solutiheys.
Viimeiseksi testasimme rinnakkaiskulttuurijärjestelmäämme pidemmällä aikavälillä käyttämällä toistuvaa eräsyöttöä, jossa AI-2:ta lisättiin useaan kertaan (kuva 7). Tässä tavoitteemme oli laajentaa populaatiorataa pidemmälle kuin mitä saatiin vaihtelemalla alkuperäistä koostumusta ja altistamalla kiinteälle AI-2-tasolle yksinkertaisessa eräkulttuurissa. Tällä tavoin testasimme ohjausjärjestelmän kestävyyttä. Esimerkiksi kuvassa 6 havaitsimme, että viljelmille, joiden populaatio B oli alun perin ~40 %, pystyimme saavuttamaan populaation B tasot, jotka lähestyivät 60 %, ja vain altistamalla korkeille AI-2-tasoille (>80 μM). Testaamalla toistuvaa eräjärjestelmää ajattelimme, että voisimme ajaa B-populaation yli 80 prosenttiin yksinkertaisesti uudelleen suspendoimalla ja laajentamalla järjestelmää ajallisesti. Lisäsimme rinnakkaiskulttuurimme väliaineeseen, jossa oli vaihtelevia AI-2-pitoisuuksia, ja 3 tunnin välein suspendoimme solut uudelleen tuoreeseen väliaineeseen, jossa oli lisää AI-2:ta. Välittömästi ennen jokaista resuspensiota otettiin näytteitä AI-1-pitoisuuden ja soluviljelmän koostumuksen analysoimiseksi (kuva 7a, b). Myös solutiheys ja AI-2:n aktiivisuus mitattiin (lisäkuva 7). Huomasimme, että tässä monimutkaisemmassa koeasetelmassa järjestelmä toimi yleensä suunnitellulla tavalla. Havaitsimme, että altistamalla pienemmille määrille AI-2:ta (20 ja 40 μM) pääsimme lähes 80 prosentin populaatioon B. Tämän kokeen aikana havaitsimme kuitenkin, että kokeelliset tuloksemme poikkesivat matemaattisen mallimme ennustamista tuloksista. Tarkastelimme tarkemmin tuotettua AI-1:tä ja viljelmien kasvunopeutta kunkin 3 tunnin jakson aikana saadaksemme käsityksen viljelmien dynamiikasta, joka perustui havaittuun eroavaisuuteen yksinkertaisen mallin kanssa. Esimerkiksi toisen ja kolmannen 3 tunnin jakson aikana tuotettu AI-1 oli suurempi kuin mallin ennustama. Jälkikäteen tarkasteltuna tämä oli järkevää, koska solut olivat ensimmäisen eräsyklin jälkeen jo tuottaneet LasI:tä (joka syntetisoi AI-1:tä), ja ylimääräinen AI-2 aiheutti todennäköisesti LasI:n lisätuotantoa (emme sisällyttäneet LasI:n hajoamistunnistetta, joten sen säilyminen olisi pitänyt ennakoida). Tämän jälkeen säädimme mallia siten, että AI-1:n tuotantonopeus jokaisen seuraavan uuteen väliaineeseen suspendoimisen alussa oli sama kuin edellisen syklin lopussa (kuva 7c, yhtenäiset viivat). Kun nämä uudet AI-1-tuotantoa koskevat funktiot sisällytettiin malliin, saatiin AI-1:lle arvot, jotka sopivat hyvin kokeellisiin AI-1-tietoihin (kuva 7a, malli yhtenäisillä viivoilla). Samoin arvioimme ohjainsolujen kasvunopeuden (ks. lisähuomautus 1) ja havaitsimme, että kasvunopeus yhdessä AI-1-pitoisuuksien kanssa ei sopinut aiempaan fAI1-funktioomme (kuva 7d). Huomautamme, että ohjainsolujen kasvunopeuden laskemiseksi oletimme, että kääntäjäsolujen kasvunopeus pysyi vakiona, vaikka ne ovat saattaneet laskea hieman toistuvien AI-2 -lisäysten seurauksena. Vaikka ohjainsolujen kasvunopeus näytti aluksi kasvavan AI-1:n funktiona, kun solut suspendoitiin uudelleen tuoreeseen väliaineeseen, kokonaiskasvunopeus laski. Olimme aiemmin havainneet kasvunopeuden dynaamisen laskun HPr:n ja LasI:n yliekspression yhteydessä (täydentävät kuvat 4 ja 5). Epäilemme, että joko toistuva altistuminen korkeille AI-1-pitoisuuksille tai substraatti- tai ravinnetasojen väheneminen ovat voineet olla syynä kasvun vähenemiseen myöhemmissä sykleissä. On tärkeää, että mukauttamalla malliamme siten, että AI-1:n vaikutus kasvunopeuteen väheni ajan myötä (ks. lisähuomautus 2), pystyimme sovittamaan kokeelliset tietomme (kuva 7b, mukautettu malli yhtenäisillä viivoilla) lisäämättä mallin monimutkaisuutta.
Ko-kulttuuriympäristö toistuvassa eräkasvatusasetelmassa. A:n ja B:n yhteiskulttuurit inokuloitiin kokonaislähtö-OD:hen ~0,05 väliaineeseen, jossa oli ilmoitettu määrä AI-2:ta. Viljelmät pyöräytettiin 3 tunnin välein ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen väliaineeseen, jossa oli AI-2:ta. Ennen uudelleensuspensiota otettiin näytteet AI-1-tason ja yhteiskulttuurin koostumuksen analysointia varten. a Viljelmien AI-1-taso inokulaatiohetkellä (t = 0) ja kunkin 3 tunnin jakson lopussa. Tietopisteet kuvaavat kokeellisia tietoja ja viivat oikaistua mallia. Virhepalkit edustavat s.d.:tä biologisten kaksoiskappaleiden välillä. b Populaation B osuus inokulaatiohetkellä (t = 0) ja kunkin 3 tunnin jakson lopussa. Tietopisteet osoittavat kokeelliset tiedot. Yhtenäiset viivat edustavat mukautetun mallin ennustamaa populaation B osuutta. Katkoviivat edustavat mukautetun mallin ennustamaa populaatioiden A ja B välisen kasvunopeuden eroa. Virhepalkit edustavat s.d.:tä biologisten kaksoiskappaleiden välillä. c AI-1:n tuotantonopeus ajan funktiona kullakin AI-2-tasolla (fAI), jota käytettiin alkuperäisessä mallissa (katkoviivat) ja mukautetussa mallissa (yhtenäiset viivat). d Tietopisteet ovat aikakeskiarvona laskettu kasvunopeus (populaatio B) suhteessa aikakeskiarvona laskettuun AI-1-konsentraatioon kullakin 3 tunnin jaksolla ja kullakin AI-2-konsentraatiolla. Katso lisätietoja kasvunopeuden ja AI-1:n arvioinnista täydentävästä huomautuksesta 1. Katkoviiva osoittaa alkuperäisen fHPr-funktion. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona
Yhteenvetona voidaan todeta, että yhteiskulttuurijärjestelmämme reagoi suunnitellulla tavalla riippumatta siitä, oliko se sijoitettu väliaineeseen, jossa ei ollut AI-2:ta, vai väliaineeseen, jossa oli korkea AI-2-pitoisuus. Lisäksi tuloksemme osoittivat hallittavissa olevia populaatiotiheyksiä, jotka kattoivat 40-80 prosenttia kontrollisoluista. Myös vertailu alkuperäiseen malliimme antoi tietoa siitä, miten järjestelmä käyttäytyi tässä monimutkaisemmassa koeasetelmassa; kääntäjän solut näyttivät tuottavan korkeampia AI-1-tasoja ajan mittaan, kun taas ohjainsoluilla näytti olevan vähäisempiä AI-1-säädeltyjä muutoksia kasvunopeudessa ajan mittaan.
Loppujen lopuksi malli saattaa tarjota pohjan tutkia in silico, miten tässä käytetyt strategiat autonomisesti säänneltyihin viljelmiin (joita merkitsevät signaalin säätelemä kasvuvauhti ja natiivi solu-solu-signaalinvälitys) voitaisiin laajentaa muihin järjestelmiin, mukaan lukien käyttäjän säätelemät tai ohjelmoitavissa olevat järjestelmät, jotka voidaan dynaamisesti hallita. Esimerkiksi kemostaattiviljelmät eroavat nykyisestä autonomisesta järjestelmästä siinä, että niiden tuotoksia ohjataan käyttäjän määrittelemillä syötteillä, kuten laimennusnopeudella. Ensimmäisessä vaiheessa simuloimme kemostaattikasvatettuja yhteiskulttuureja lisäämällä panosmalliin vakiovirtaustermit (täydentävä kuva 8, täydentävät taulukot 4 ja 5). Joissakin tapauksissa havaitsimme, että laimennusnopeus määrittelee viljelmän koostumuksen vakaassa tilassa, jota puolestaan voidaan myöhemmin ”virittää” laimennusnopeuden rajoittamalla alueella. ”Viritys” voidaan saavuttaa moduloimalla solu-solu-signaalinvälitystä ulkoisesti esimerkiksi lisäämällä eksogeenisesti signaalimolekyylejä. Nämä tapaukset havainnollistavat, miten autonomisen järjestelmämme ja muiden käyttäjän ohjaamien järjestelmien välinen vuorovaikutus voi johtaa monimutkaisempiin populaatioratoihin. Tässä esitetyt simulointituloksemme toimivat käsitteellisenä kehyksenä konsortioiden koostumuksen ohjaamiselle monimutkaisemmissa, käyttäjän ohjaamissa järjestelmissä. Sytostaattisimulaatioita käsitellään tarkemmin lisähuomautuksessa 3.