Elisabeth avioitui Espanjan Filip II:n, Pyhän Rooman keisarin Kaarle V:n ja Portugalin Isabellan pojan kanssa vuonna 1559. Alun perin avioliitto solmittiin valtakirjalla Notre Damessa (Alban herttua edusti Philipiä) ennen Ranskasta lähtöä, mutta varsinainen seremonia pidettiin Guadalajarassa, Espanjassa, hänen saavuttuaan. Avioliitto oli seurausta Cateau Cambrésisin rauhasta (1559). Hänen toinen vaimonsa, Englannin Maria I, oli hiljattain kuollut, joten Elisabeth Valois’sta tuli Filipin kolmas vaimo.
Häissään hän tapasi taidemaalari Sofonisba Anguissolan ja Ana de Mendozan, joka asui hänen kanssaan koko loppuelämänsä. Filip II nimitti Anguissolan kuningattarensa hovineidoksi ja hovimaalariksi. Anguissolan ohjauksessa Elisabeth paransi amatöörimaalaustaitojaan. Anguissola vaikutti hovissa ollessaan myös hänen lastensa Isabella Clara Eugenian ja Caterina Michaelan taiteellisiin töihin.
Philippe oli täysin lumoutunut 14-vuotiaasta morsiamestaan, ja vuoteen 1564 mennessä hän oli luopunut uskottomuudestaan. Merkittävästä ikäerosta huolimatta myös Elisabeth oli varsin tyytyväinen mieheensä. (Äidilleen lähettämissään kirjeissä hän julisti olevansa onnekas, että oli mennyt naimisiin niin hurmaavan prinssin kanssa.) Filip nautti ritarillisten turnausten järjestämisestä vaimonsa viihdyttämiseksi. Elisabeth esitti Espanjan hovin kolmen nuoren prinssin lojaliteettia: Carlos, Asturian prinssi, Johannes Itävallan (Kaarle V:n avioton poika) ja Alexander Farnese, Parman herttua (Kaarle V:n aviottoman tyttären Margaretan poika).
Elisabeth oli alun perin kihlattu Filippin pojalle, Kaarle V:n Asturian prinssille Carlosille, mutta poliittisten komplikaatioiden vuoksi avioliitto Filippin pojan kanssa oli sen sijaan välttämätöntä. Hänen suhteensa vaikeuksissa olevaan poikapuoleensa Carlosiin oli lämmin ja ystävällinen. Huolimatta kertomuksista, joiden mukaan Carlos käyttäytyi yhä oudommin, hän oli aina ystävällinen ja lempeä Elisabethille. Kun Filip lopulta joutui lukitsemaan hänet pois (mikä johti pian prinssin kuolemaan), Elisabeth itki päiväkausia.
Filippi kiintyi erittäin paljon Elisabethiin, ja hän pysytteli tiiviisti Elisabetin vierellä jopa silloin, kun tämä sairastui isorokkoon. Elisabethin ensimmäinen raskaus vuonna 1560 johti kuolleena syntyneeseen poikaan, jota seurasi vuonna 1564 kaksostyttöjen keskenmeno. Myöhemmin hän synnytti 12. elokuuta 1566 Espanjan infantti Isabella Clara Eugenian ja 10. lokakuuta 1567 Isabellan nuoremman sisaren Katariina Michellen. Filip ja Elisabeth olivat hyvin läheisiä molemmille tyttärilleen ostamalla heille hilloja, nukkeja, leluja ja paljon muuta. Sanotaan, että ”molemmat iloitsivat Isabellan syntymästä aivan kuin se olisi ollut pojan syntymä”. Elisabeth sai toisen keskenmenon 3. lokakuuta 1568 ja kuoli samana päivänä yhdessä vastasyntyneen pikkutyttärensä kanssa.
Elisabethin kuoleman jälkeen Katariina de’ Medici tarjosi nuorempaa tytärtään Margaretaa morsiameksi Filipille. Filip kieltäytyi tarjouksesta.