FLAG-tag

FLAG-tag eli FLAG-oktapeptidi tai FLAG-epitooppi on polypeptidiproteiinimerkki, joka voidaan lisätä proteiiniin rekombinantti-DNA-tekniikalla ja jolla on sekvenssimotiivi DYKDDDDK (jossa D=asparagiinihappo, Y=tyrosiini ja K=lysiini). Se on yksi spesifisimmistä tunnisteista, ja se on keinotekoinen antigeeni, jolle on kehitetty spesifisiä, korkean affiniteetin monoklonaalisia vasta-aineita, ja sitä voidaan käyttää proteiinien puhdistamiseen affiniteettikromatografialla ja myös proteiinien paikantamiseen elävissä soluissa. Sitä on käytetty rekombinanttisen, yliekspressoidun proteiinin erottamiseen isäntäorganismin ekspressoimasta villityyppisestä proteiinista. Sitä voidaan käyttää myös sellaisten proteiinikompleksien eristämiseen, joissa on useita alayksiköitä, koska sen lievä puhdistusmenetelmä ei yleensä häiritse tällaisia komplekseja. Sen avulla on saatu riittävän puhtaita ja laadukkaita proteiineja 3D-rakenteen määrittämiseksi röntgenkristallografialla.

FLAG-tagia voidaan käyttää monissa erilaisissa määrityksissä, jotka edellyttävät vasta-aineen tunnistamista. Jos tiettyä proteiinia vastaan ei ole vasta-ainetta, FLAG-tagin lisääminen proteiiniin mahdollistaa proteiinin tutkimisen FLAG-sekvenssiä vastaan olevalla vasta-aineella. Esimerkkejä ovat solulokalisointitutkimukset immunofluoresenssilla, immunoprecipitaatio tai toteaminen SDS PAGE -proteiinielektroforeesilla ja Western blottingilla.

FLAG-tagin peptidisekvenssi N-terminaalista C-terminaaliin on: DYKDDDDK (1012 Da). Lisäksi sitä voidaan käyttää tandemina, yleisesti 3xFLAG-peptidinä: DYKDHD-G-DYKDHDHD-I-DYKDDDDK (viimeinen tagi koodaa enterokinaasin pilkkomispaikkaa). Se voidaan fuusioida proteiinin C-terminaaliin tai N-terminaaliin tai lisätä proteiinin sisään. Jotkin kaupallisesti saatavilla olevat vasta-aineet (esim. M1/4E11) tunnistavat epitoopin vain silloin, kun se on N-terminaalissa. Toiset saatavilla olevat vasta-aineet (esim. M2) eivät kuitenkaan tunnista paikkaa. FLAG-tagin tyrosiinijäännös voi olla sulfatoitunut, mikä voi vaikuttaa vasta-aineen FLAG-epitoopin tunnistamiseen. FLAG-tagia voidaan käyttää yhdessä muiden affiniteettimerkkien, esimerkiksi polyhistidiinimerkin (His-tag), HA-tagin tai myc-tagin kanssa.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.