Fossiilinen pehmytkudosrakenne
Pienet kudoslaikut (0,01-0,4 mm2; Fig. 1a-d ja Supplementary Figs. 2-6) liittyvät läheisesti fossiilisiin höyheniin (esim, yleensä 500 µm:n sisällä hiilipitoisten höyhenjäännösten sisällä, täydentävät kuvat 2e, g, j, k, o, s, t). Laikut ovat ehdottomasti fossiilista kudosta, eivätkä ne heijasta pinnan kontaminaatiota nykyaikaisella materiaalilla näytteen valmistuksen aikana, koska ne ovat säilyneet kalsiumfosfaatissa (ks. ”Taponomia” jäljempänä); lisäksi useissa näytteissä on reunoja, jotka ovat osittain ympäröivän matriksin peittämiä. Kudokset eivät siis ole yksinkertaisesti kiinnittyneet näytteen pintaan laboratoriossa ilmassa olevien hiukkasten aiheuttaman kontaminaation seurauksena.
Fosfatoituneet pehmytkudokset ei-avianisissa maniraptoraan dinosauruksissa ja eräässä basaalilinnussa. a-h Takaisinsirontaelektronikuvat kudoksista Confuciusornisissa (IVPP V 13171; a, e, f), Beipiaosauruksessa (IVPP V STM31-1; b, g), Sinornithosauruksessa (IVPP V 12811; c, h) ja Microraptorissa (IVPP V 17972A; d). Poikkileikkauksissa ja murtopinnoilla näkyy sisäinen kuitumainen kerros (1,0-1,2 µm paksu) kahden ohuemman rakenteettoman kerroksen (0,2-0,5 µm paksu) välissä (kuva 1f-h). Rakenteettoman kerroksen ulkopinta on sileä, ja siinä voi näkyä hienovarainen monikulmainen rakenne, jota määrittävät 10-15 µm:n levyiset monikulmiot (kuvat 1e, h).
Kuitukerroksessa näkyy myös monikulmioita (kuvat 1f, h ja 2a-e sekä täydentävä kuva 6), jotka sisältävät tiheästi pakattujen, 0,1-0,5 µm:n levyisten kuitujen muodostamia ryppäitä (kuvat 2f-i ja täydentävä kuva 5f). Hyvin säilyneissä kuiduissa on helikoidista kiertymistä (kuvat 2h, i). Kunkin monikulmion reunaosissa olevat kuidut ovat 0,1-0,3 µm leveitä ja suuntautuneet kudoksen pinnan suuntaisesti; kunkin monikulmion sisäosissa olevat kuidut ovat 0,3-0,5 µm leveitä ja yleensä kohtisuorassa kudoksen pintaan nähden (Kuva 2b, h ja Täydentävä kuva S6d). Kunkin monikulmion 1-2 µm:n marginaalissa kuidut ovat yleensä kohtisuorassa lateraaliseen monikulmion reunaan nähden, ja ne päättyvät vierekkäisiin monikulmioihin tai silloittavat viereisten monikulmioiden välisen liitoskohdan (kuvat 2f, g ja täydentävä kuva 6e). Monikulmiot ovat yleensä samanmittaisia, mutta paikallisesti pitkänomaisia ja toisiinsa nähden samansuuntaisia, jolloin kunkin monikulmion paksut kuidut ovat kudospinnan alapuolella ja ohuet kuidut monikulmion reunan suuntaisia (kuvat 2j, k ja täydentävät kuvat 6g-l). Joissakin monikulmioissa on keskeinen syvennys (kuva 2c-e ja täydentävä kuva 6a-c), jossa paksut kuidut voivat ympäröidä 1-2 µm leveän pallomaisen rakenteen (kuva 2e).
Pehmytkudosten rakenne Confuciusornisissa (IVPP V 13171). a, b Takaisinsirontaelektronimikroskooppikuvat; kaikki muut kuvat ovat sekundaarielektronimikroskooppikuvia. a, b Tiiviisti pakattuja monikulmioita. c Yksityiskohta monikulmioista, joissa näkyy kuitupitoinen sisältö, ja d tulkitseva piirros. e-g Monikulmio (e), jossa on merkittyjen alueiden yksityiskohdat, joissa näkyy tonofibrillit, jotka muodostavat sillan (f) ja törmäävät (g) monikulmioiden väliseen liitoskohtaan. h, i Tonofibrillien kierteinen käämitys. h Monikulmion viisto näkymä, jossa keskimmäiset tonofibrillit ovat suuntautuneet kohtisuoraan monikulmion pintaan nähden. j, k Polygonit, joissa näkyy venytyksen kaltaista muodonmuutosta
Fossiiliset korneosyytit
Tämän fossiilisen kudoksen rakenne eroaa isäntäkerrostumasta peräisin olevien simpukankuorien ja kalan suomujen, nykyaikaisen Mytiluksen kuoren, nykyaikaisen ja fossiilisen höyhenenenrungon ja nykyaikaisen matelijan epidermaalin tekstuureista (Täydentävät kuviot 7a-n). Joidenkin monikulmioiden pitkänomainen geometria (kuvat 2j, k ja täydentävät kuvat 6g, l) viittaa ei-biomineralisoituneen kudoksen elastiseen muodonmuutokseen mekaanisen rasituksen vaikutuksesta. Kokonsa, geometriansa ja sisäisen rakenteensa perusteella monikulmaiset rakenteet tulkitaan sarveissoluiksi (epidermiksen keratinosyytit). Nykyaikaisilla amnioteilla nämä ovat monikokoisia, litistyneitä soluja (1-3 µm × n. 15 µm), jotka ovat täynnä keratiinin tonofibrillejä, lipidejä ja matriisiproteiineja18,19,20 (kuva 3a, b ja täydentävät kuvat 2u-x, 8, 9). Fossiilimateriaalin uloin strukturoimaton kerros vastaa solun reunaa; se on paksumpi kuin alkuperäinen biologinen malli eli sarveissolun kuori ja/tai solukalvo, mutta tämä ei ole odottamatonta, sillä se heijastaa kalsiumfosfaatin aiheuttamaa diageneettistä umpeenkasvua (ks. ”Taphonomia”). Fossiilisten sarveissolujen kuidut on tunnistettu mineralisoituneiksi tonofibrilleiksi, jotka ovat suoria, haarautumattomia, 0,25-1 µm:n levyisiä ylikierrettyjä α-keratiinifibrillejä18,21 , jotka ovat sarveissolujen sytoskelettirakenteen pääkomponentti22 ja joita ympäröivät amorfiset sytoskelettiproteiinit22. Fossiileissa ohuet tonofibrillit sivuavat usein viereisen solun ohuita tonofibrillejä (kuva 2g ja lisäkuva 6e), mutta paikoitellen ne voivat ylittää viereisten solujen välisen rajan (kuva 2f). Jälkimmäinen muistuttaa desmosomeja, nykyaikaisten sarveissolujen välisiä vahvoja solujen välisiä kiinnittymisalueita23. Fossiilisten sarveissolujen keskeiset pallomaiset rakenteet muistuttavat kuolleiden solujen tumia24 , kuten nykyisten lintujen (mutta ei nykyisten matelijoiden ja nisäkkäiden)24 sarveissoluissa (täydentävä kuva 8). Näiden pyknoottisten ytimien sijainti näkyy usein painaumina sarveissolujen pinnassa nykyisillä linnuilla24 (kuva 3b); joissakin fossiilisissa soluissa on samanlaisia painaumia (kuva 2c ja täydentävä kuva 6a-c).
Korneosyytit sukupuuttoon kuolleilla linnuilla. a-d Pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvat kuoriutuneesta ihosta sukupuuttoon kuolleella seepiansuomulla (Taeniopygia guttata (n = 1); a-d). a Korneosyytit määrittelevät monikulmaisen tekstuurin. b Keskeinen syvennys (nuoli) merkitsee pyknoosin ytimen sijaintia. c, d Sulkien sisälle kiinnittyneet irronneet ihohiutaleet
Tafonomia
Tafonomia
Keratiini on verrattain vaikeasti ristisilloittuneen parakiteisen rakenteensa ja hydrofobisen, ei-niin-epolaarisen luonteensa takia suhteellisen vaikeaselkoinen biomolekyylilajitelma23. Fossiilisten sarveissolujen monistuminen kalsiumfosfaattiin on näin ollen jokseenkin odottamatonta, sillä tämä prosessi edellyttää yleensä jyrkkiä geokemiallisia gradientteja, jotka ovat tyypillisiä varhaiselle hajoamiselle25 , ja sitä sovelletaan yleensä hajoamisalttiisiin kudoksiin, kuten lihakseen26 ja ruoansulatuskudoksiin27. Vastustuskykyiset kudokset, kuten ihon kollageeni, voidaan kuitenkin monistaa kalsiumfosfaattiin, jos niissä on luontainen kalsiumin lähde ja erityisesti hajoamisen aikana vapautuvia fosfaatti-ioneja28. Korneosyytit sisältävät molempien ionien lähteitä. Terminaalisen erilaistumisen aikana solunsisäiset kalsiumpitoisuudet kasvavat29 ja α-keratiiniketjut fosforyloidaan laajasti23. Lisäksi sarveissolujen lipidirakeet30 sisältävät runsaasti fosforia ja fosfaattia31. Nämä kemialliset osat vapautuisivat granuloiden hajotessa ja saostuisivat jäljelle jäävään orgaaniseen substraattiin eli tonofibrilleihin.
Nisäkkäillä tiheästi pakkautuneet tonofibrillien ruudukot vaativat stabiliteettinsa vuoksi runsaasti interkeratiinimatriisiproteiineja32. Näitä proteiineja ei kuitenkaan näy fossiileissa. Tämä ei ole odottamatonta, sillä proteiinit ovat harvinaisia lintujen nykyisissä sarveissoluissa33 ja, mikä kriittistä, ne esiintyvät hajallaan olevina monomeereinä34 , ja niiden säilymispotentiaali on heikompi kuin tonofibrillien voimakkaasti ristisilloittuneiden ja polymerisoituneiden keratiinikimppujen. Fossiilisten sarveissolujen ulompi rakenteeton kerros on paksumpi kuin todennäköinen biologinen malli (tai biologiset mallit) eli sarveissolukalvo (lipideistä, keratiinista ja muista proteiineista koostuva, jopa 100 nm:n paksuinen kerros, joka korvaa solukalvon terminaalisen erilaistumisen aikana34 ) ja/tai solukalvo. Tämä saattaa heijastaa paikallista mikroympäristöä, joka edistää kalsiumfosfaatin saostumista: terminaalisen erilaistumisen aikana kehittyvien sarveissolujen periferiaan kertyy keratohyaliinirakeita, jotka ovat laajasti fosforyloitunut proteiini35 ja joilla on suuri affiniteetti kalsiumioneihin36 . Kalsiumfosfaatin ulomman kiinteän kerroksen paksuus fossiileissa sekä asteittainen siirtyminen siitä sisäiseen kuitukerrokseen viittaavat siihen, että fosfaatin saostuminen eteni reunoilta sarveissolujen sisäosiin. Tässä skenaariossa fosfaatin saatavuus solujen reunavyöhykkeillä olisi ylittänyt tonofibrillien monistumiseen tarvittavan määrän. Ylimääräinen fosfaatti olisi saostunut kalsiumfosfaattina tonofibrillien välitiloissa, jotka etenivät sisäänpäin solun reunan sisäpinnalta.
Ihon irtoaminen sulkasääskisillä dinosauruksilla ja varhaislinnuilla
Ulkuperäisillä amniooteilla epidermaalinen sarveistunut kerros on tyypillisesti 5-20 solun paksuinen (mutta paksuus vaihtelee lajeittain ja sijainnin mukaan kehossa38). Fossiilisten sarveissolujen laikut ovat kuitenkin yhden solun paksuisia (kuva 1f ja täydentävät kuvat 5c, 10). Tämä sekä laikkujen johdonmukaisen pieni koko (<400 μm) ja huomattavan hyvä säilyvyys eivät ole ristiriidassa jatkuvan kudoskerroksen valikoivan säilymisen kanssa in situ. Vähemmistössä (n = 8) esimerkeistä iho esiintyy fossiilisten pehmytkudosten näytteen reunalla ja voisi siten mahdollisesti edustaa pienempää fragmenttia alun perin suuremmasta fossiilisen ihon palasta (palan loppuosan ollessa fossiililaatassa). Useimmissa esimerkeissä ihon fragmentin koko ääriviiva sisältyy kuitenkin näytteen reunaan. Eri näytteiden reunojen tarkastelu suurennoksella paljastaa, että näyte ja ympäröivä sedimentti ovat usein täsmälleen samassa tasossa (esim. täydentävä kuva 10). Silloinkin, kun ihonäytteen marginaali on sedimentin peitossa, näyte ei todennäköisesti ole ollut paljonkaan näennäistä kokoa suurempi, sillä fossiilinen iho muodostaa lähes täydellisen tasomaisena luonnollisen halkaisutason.
Ei ole todisteita siitä, että ihon säilynyt paksuus olisi preparoinnin tai eroosion aiheuttama artefakti. Kalliolaatan halkaisun aikana halkaisutaso kulkee usein epätasaisesti pehmytkudosten läpi paljastaen eri syvyyksissä olevia rakenteita. Tässä tutkituissa fossiileissa halkaisutaso kulkee yleensä sarveissolujen läpi (paljastaen niiden sisäisen rakenteen) ja harvoin sarveissolukerroksen ulkopintaa pitkin. Useamman kuin yhden sarveissolukerroksen irtoamisesta ei ole todisteita: FIB-poikkileikkauksissa näkyy vain yhden kerroksen säilyminen, ja useissa SEM-kuvissa näkyy täydellisiä pystysuoria leikkauksia säilyneen ihon läpi (joissa suhde ylä- ja alapuoliseen sedimenttiin on näkyvissä), ja niissä on näyttöä vain yhdestä sarveissolukerroksesta. Fossiilisten sarveissolujen kuitumainen sisäinen täyte paljastuu siellä, missä fossiilisen laatan halkaisutaso kulkee kudoslaikkujen läpi. Fossiilisten sarveissolujen topografia kuitenkin vaihtelee halkaisutason sijainnin mukaan, joka voi vaihdella paikallisesti pehmytkudoksen läpi millimetrin mittakaavassa: sarveissoluissa voi esiintyä koholla olevia reunoja ja keskellä olevaa painaumaa tai painaumia ja keskellä olevaa koholla olevaa vyöhykettä (kuva S9).
Sarveissolujen laikkujen koko, epäsäännöllinen geometrinen muotoilu ja paksuus muistuttavat sarveissolukerroksen irronneista hiutaleista koostuvia hiutaleita (hilseiden kaltaisia hiutaleita)39 ; kuva 3). Nykyisillä linnuilla sarveissoluja irtoaa yksittäin tai jopa 0,5 mm2 :n kokoisina laikkuina, jotka voivat olla höyhenissä (kuva 3c, d ja täydentävä kuva 2u, v). Tässä kuvatut fossiilit tarjoavat ensimmäiset todisteet ihon irtoamisprosessista basaalilinnuilla ja ei-avianisilla maniraptodinosauruksilla ja vahvistavat, että ainakin jotkut ei-avianiset dinosaurukset irtoavat ihoaan pieninä laikkuina40. Tämä irtoamistapa on samanlainen kuin nykyaikaisilla linnuilla18 (kuva 3c, d) ja nisäkkäillä20 , ja se viittaa jatkuvaan somaattiseen kasvuun. Tämä on ristiriidassa monien nykyisten matelijoiden, esim, lepidosaurukset, jotka irrottavat ihonsa kokonaisina tai suurina osina21 , mutta irtoamistyyliin voivat vaikuttaa sellaiset tekijät kuin ruokavalio ja ympäristö41.
Fossiilisten sarveissolujen rakenteen evolutiiviset vaikutukset
Fossiilisten sarveissolujen rakenteessa on havaittavissa keskeisiä sopeutumismuotoja, jotka löytyvät nykyisten lintujen ja nisäkkäiden vastaavista eläimistä, erityisesti litistynyt, monikulmionmuotoinen geometrinen rakenne ja α-keratiinitonin tonofibrillejä muistuttava solujen solujen solukkokudos16. Lisäksi fossiilisissa tonofibrilleissä (kuten nykyisissä esimerkeissä22 ) on vahvoja solujen välisiä yhteyksiä, ja ne muodostavat jatkuvan telineen koko sarveissolukerroksen läpi (kuvat 2b, c, j ja täydentävä kuva 6). Sitä vastoin nykyisten matelijoiden sarveissolut sisältävät homogeenista β-keratiinimassaa (ja muita proteiineja solukuoressa), ja ne fuusioituvat kehityksen aikana muodostaen kypsiä β-kerroksia ilman selviä solurajoja42. Pyknoottisten ytimien säilyminen fossiilisissa sarveissoluissa on selvästi lintuihin liittyvä piirre, jota ei esiinny nykyaikaisissa matelijoissa (ks. kuitenkin viite 20).
Epidermisen morfogeneesin ja erilaistumisen katsotaan eronneen toisistaan therapsideissa ja sauropsideissa31. Tietomme tukevat muita todisteita siitä, että lintujen ja nisäkkäiden yhteiset epidermaaliset piirteet viittaavat konvergenttiin evoluutioon43 , ja viittaavat siihen, että lipidirikkaat sarveissolujen sisällöt voivat olla evolutiivisesti johdettuja piirteitä linnuilla ja höyhenillä varustetuilla ei-avian maniraptoraneilla. Evo-devo-tutkimuksissa on ehdotettu, että lintujen epidermis on voinut syntyä ”protosulkia” kantavan suomuisen ihon saranakohtien laajenemisen seurauksena20. Vaikka fossiiliset todisteet tästä siirtymästä puuttuvat, tietomme osoittavat, että lintujen ja muiden kuin maniraptoriaanisten dinosaurusten epidermis oli jo kehittynyt selvästi nykyaikaiseksi, jopa sellaisilla taksoneilla, jotka eivät kyenneet moottorilentoon. Tämä ei sulje pois sitä mahdollisuutta, että ainakin jotkin tässä kuvatuista epidermiksen piirteistä ovat peräisin basaalisemmilta theropodeilta, erityisesti silloin, kun säilyneessä ihossa ei ole viitteitä suomuista (kuten Sciurumimuksella44 ). Keratiinin monimutkaista ilmentymistä epidermiksessä45 , keratinosyyttien terminaalista erilaistumista ja α- ja β-keratiinisynteesin jakautumista sulkaeläinten ihossa32 moduloivat hienostuneet genomiset mekanismit, jotka todennäköisesti muokkautuivat sulkien evoluution myötä lähellä Maniraptora-heimon pohjaa myöhäiskeskijurakauden lopulla (kuva 4). Olemassa olevat fossiiliaineistot viittaavat siihen, että tämä tapahtui sen jälkeen, kun Maniraptoriformes-heimon nokka oli kehittynyt, ja ennen kuin eturaajojen patagia ja pterylae kehittyivät (kuva 4); kaikkien näiden piirteiden ensimmäiset fossiiliset esiintymät ajoittuvat n. 10-15 Ma:n päähän, mikä viittaa siihen, että höyhenpeitteen evoluutiossa tapahtui innovaatiopyrähdys lähellä alemman ja keskimmäisen jurakauteen ulottuvaa rajaa ja sen yli. Varhaisimmat todisteet höyheniin liittyvästä iholihaksistosta ovat noin 30 miljoonaa vuotta nuoremmat, 125 miljoonaa vuotta sitten eläneessä ornithothoracea-linnussa17. Kun otetaan huomioon tämän ihoverkoston olennainen rooli höyhenien tukemisessa ja sulkien suuntautumisen hallinnassa18 , sen puuttuminen höyhenillä varustetuista ei-avian maniraptoriaaneista saattaa heijastaa taphonomista harhaa.
Skeemaattinen, geologiseen aikaan suhteutettu, valikoitujen kelurosaurusten fylogeneesi, jossa näkyy keskeisten ihomodifikaatioiden hankkimisen malli. Fylogenia on todennäköisin maksimaalisen todennäköisyyden malleista, jotka perustuvat minimihaarojen pituuksiin (mbl) ja siirtymiin, jotka tapahtuvat all-rates-different (ARD) -malleina. Kynsiä ja jalkapohjia pidetään alkeellisina koelurosauruksilla. Käytettävissä olevat tiedot viittaavat siihen, että modifioidut keratinosyytit ja jatkuva irtoaminen ovat peräisin läheltä Maniraptora-heimon pohjaa; tämän ennustetaan siirtyvän tulevien fossiililöytöjen perusteella kohti Coelurosauria-heimon pohjaa muiden höyhenpeitteisten taksonien suuntaan
Tietyiltä osin fossiiliset sarveissolut ovat selvästi ei-aviolaisia ja viittaavat siihen, että höyhenpeitteisillä dinosauruksilla ja varhaislinnuilla oli ainutlaatuinen sisäelinten anatomia ja fysiologia, joka oli siirtymäkausi nykyaikaisten lintujen ja ei-söyhenpeitteisten dinosaurusten välillä. Nykyisillä linnuilla sarveissolujen tonofibrillit ovat levittäytyneet löyhästi solunsisäisten lipidien sekaan19; tämä helpottaa haihtumisjäähdytystä vastauksena lennon aikana tapahtuvaan lämmöntuotantoon ja höyhenpeitteen eristämiseen46. Sitä vastoin fossiiliset tonofibrillit ovat tiiviisti pakkautuneita ja täyttävät solun sisäosan. Fossiilisten sarveissolujen kuolemanjälkeisestä kutistumisesta ei ole todisteita: koko vaihtelee nykyaikaisten lintujen sarveissolujen koon mukaan, eikä diageneettisestä rypistymisestä, vääntymisestä tai yksittäisten solujen erottumisesta ole merkkejä. Tämä viittaa vahvasti siihen, että fossiilisten sarveissolujen säilynyt tonofilamenttien tiheys kuvastaa alun perin suurempaa tiheyttä kuin nykyisissä linnuissa. Tämä ei ole ruumiinkoon funktio: erikokoisilla nykyisillä linnuilla (esim. seeprakärpänen ja strutsi) on löyhästi hajallaan olevia tonofibrillejä47. Fossiilisten lintujen fysiologinen tarve haihtumisjäähdytykseen on siis todennäköisesti ollut pienempi, ja lentotoimintaan liittyvä kehon lämmöntuotanto on puolestaan ollut vähäisempää46 kuin nykyisillä linnuilla. Tämä on sopusoinnussa muiden todisteiden kanssa matalasta perusaineenvaihdunnasta ei-avianisilla maniraptori-dinosauruksilla47,48 ja peruslinnuilla47 sekä sellaisten hypoteesien kanssa, joiden mukaan Microraptorin49 ja mahdollisesti Confuciusornisin48 (mutta ks. viite 50) höyhenet eivät olleet sopeutuneet moottoroidun lennon harjoittamiseen ainakaan pitkiä aikoja50.
.