Histidiiniprotonaation ja rotameeristen tilojen vaikutus M. tuberculosis RmlC:n virtuaaliseen seulontaan

Voittaaksemme arvioida histidiiniprotonaation ja rotameeristen tilojen vaikutusta reseptorien ennustuskykyyn suoritimme virtuaalisen seulonnan (VS) Mtb:n entsyymille RmlC aikaisemman korkean läpimenon seulontatutkimuksen (highthroughput screening, HTS) tulosten perusteella. Jäljempänä tarkastelemme ensin rinnakkaiskiteisen ligandin TRH:n tyypillisiä vuorovaikutuksia tutkiaksemme ligandin asennon riippuvuutta histidiiniprotonaatiosta. Lisäksi kontekstualisoimme eri reseptorimallien rikastussuorituskyvyn ja ennustuskyvyn analyysin keskustelemalla vuorovaikutuksista reseptorin kanssa osoittaaksemme erilaisten histidiiniprotonaatiotilojen vaikutuksen VS:ään. Lopuksi vertaamme useilla yleisillä pKa-laskentapaketeilla laskettuja ennustettuja pKa-arvoja reseptorin protonoitumistiloihin, joilla on paras ennustuskyky.

TRH:n telakointi

TrH:n rinnakkaiskiteisen ligandin telakointi takaisin 36:een reseptorimalliin suoritettiin, jotta saatiin selville poseerauksen eli ligandin orientaation riippuvuus reseptoriin nähden histidiiniprotonaatio- ja rotaameritiloista. Kemiallisesti intuitiiviset vetysidosmallit His62:n ja His119:n kidekoordinaateille, jotka on esitetty kuvassa 2b, viittaavat vetysidosten mahdolliseen merkitykseen TRH:n telakoitumisessa. Tämän ligandin telakointi mahdollisti alustavan tarkastelun poseerauksen riippuvuudesta mahdollisista vetysidosverkostoista reseptorin kanssa.

Histidiinin protonoitumistilojen vaihtelulla on selvä vaikutus poseerauksen ennustamiseen määritetylle rinnakkaiskide-ligandille. RMSD itsedockatun TRH:n telakointiposeista kideroordinaatteihin His62:n ja His119:n eri protonoitumis- ja rotaatiotiloille vaihteli 2,91-5,44 Å:n välillä. Molempien histidiinien protonoitumistila, jolla oli paras keskimääräinen RMSD, on HIE, joka vastaa TRH:n kideroordinaattien todennäköisimpiä protonoitumistiloja. Kaikissa tapauksissa telakointialgoritmi ennustaa myös ligandin pyrofosfaatin sijainnin oikein, mutta suuri poikkeama kristallikoordinaateista johtuu pääasiassa tymidiini- ja ramnoosiryhmien kääntymisestä pyrofosfaatin ympärillä, mikä johtaa erilaisiin vetysidoskuvioihin TRH:n ja kahden histidiinin välillä. Tämä osoittaa His62:n ja His119:n kanssa muodostuvien vetysidosverkostojen merkityksen TRH:n rinnakkaiskide-ligandin poseerauksen ennustamisessa. Tutkittuamme poseerausriippuvuutta kahden histidiinin tarjoamista vetysidoksista laajensimme siksi tutkimustamme tarkastelemaan systemaattisesti yhdisteiden järjestystä VS:ssä ja sitä, miten histidiinien protonoitumis- ja rotaameritilat vaikuttavat siihen.

Virtuaalinen seulonta

Molekulaarinen telakointi suoritettiin, jotta voitiin tutkia yhdisteiden järjestyksen riippuvuutta histidiinien protonoitumis- ja rotaameritiloista. Ligandijoukko sisälsi kymmenen aktiivista ja 2000 inaktiivista, jotka valittiin satunnaisesti HTS:stä. Todettakoon, että Tanimoto-pisteet osoittavat, että useimpien haitta-aineiden samankaltaisuus aktiivisten aineiden kanssa on alhainen. Tällainen houkutusainejoukko on pienempi haaste telakointialgoritmille, ja VS:n ennustuskykyyn saattaa vaikuttaa, kun käytetään houkutusaineita, joilla on suurempi samankaltaisuus aktiivien kanssa. Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan haluttu tutkia telakointialgoritmin ennustuskykyä sinänsä, vaan sitä, miten histidiinin protonoitumistilat vaikuttavat VS:n suhteelliseen suorituskykyyn.

Dockattuja aktiivisia ligandeja ja tuoteanalogia tutkittiin aluksi tärkeiden vuorovaikutusten luonnehtimiseksi RmlC:n sitoutumiskohdassa. Kaikissa reseptorimalleissa hydrofobiset pi-pi-pinointivuorovaikutukset vaikuttavat merkittävästi aktiivisten yhdisteiden telakointitulokseen RmlC:n aktiivisessa kohdassa. HTS:stä saatu alkuperäinen hittiyhdiste, SID7975595, sijoittuu korkealle useimmissa reseptorimalleissa, 8. ja 51. sijan välille 26:ssa 36 reseptorista. Vaikka SID7975595:n ja yhteiskiteisen ligandin TRH:n välillä on vain vähän rakenteellista samankaltaisuutta, SID7975595:n trisyklinen rengas korvaa helposti TRH:n tymidiiniryhmän, kun taas bentsimidatsolonirengas korvaa ramnoosiryhmän, mikä tarjoaa rakenteellisen perustan inhibitiolle. Kuten kuvasta 3 käy ilmi, aktiivisten aineiden ja reseptorin väliseen hydrofobiseen vuorovaikutukseen osallistuvat usein Tyr132 ja Tyr138 ketjusta A ja Phe26 ketjusta B (huomaa, että osa ketjusta B tunkeutuu ketjun A aktiiviseen kohtaan). Koska aktiiviset aineet ovat vuorovaikutuksessa välttämättömien sitoutumiskohdan jäännösten kanssa ja estävät vesimolekyylien pääsyn Phe26:een ja Tyr132:een, ne tarjoavat runsaasti hydrofobisia kontakteja korkean sitoutumisaffiniteetin saavuttamiseksi. Kuten Sivendran et al. käsittelevät, SID7975595:n trisyklisen renkaan typpeen kiinnitetyn etyyliryhmän korvaaminen allyyliryhmällä (esim. vaikuttava yhdiste 77074) parantaa sitoutumisaffiniteettia entisestään muodostamalla entistäkin tiukemman hydrofobisen tiivisteen. Sen sijaan tämän ryhmän korvaaminen pienemmällä metyyliryhmällä tai vetyatomilla johtaa alhaisempaan sitoutumisaffiniteettiin . Edellä kuvattujen hydrofobisten kontaktien lisäksi jotkin aktiiviset aineet muodostavat vetysidoksia myös Ser51:n, Arg59:n ja Arg170:n kanssa. Kuvio, jossa kuvataan telakoitujen vaikuttavien aineiden vuorovaikutukset, löytyy verkkolähteestä 3.

Huomionarvoista on, että aktiiviset aineet eivät yleensä saavuta polaarisia vuorovaikutuksia His62:n ja His119:n kanssa. Kuten kuvassa 3 on esitetty, SID7975595:n karbonyylihappi ja kaksi bentsimidatsolonin nitrogeenia osoittavat poispäin His62:sta ja His119:stä. Aktiivien aromaattisten vetyhydrogeenien suunta ei useinkaan pysty osallistumaan vetysidosverkostoihin kahden histidiinin kanssa. Silti näiden histidiinien erilaiset protonoitumis- ja rotaameritilat vaikuttavat VS-tuloksiin niiden vuorovaikutusten kautta houkutteiden kanssa.

Ranking-erojen arviointi

Ei ole harvinaista, että vain 1 % seulotuista yhdisteistä voidaan kokeellisesti testata VS-tutkimuksessa rajallisten resurssien vuoksi. Siksi rikastuskerroin (EF)1 %, joka kuvastaa tietokannan rikastustulosta kirjaston ylimmässä 1 %:ssa (20 telakoitunutta yhdistettä), on erityisen tärkeä arvioitaessa VS:n ennustuskykyä. EF1% vaihtelee välillä 0-80 36 reseptorimallissa (taulukko 1), mikä osoittaa, että VS-tulokset ovat herkkiä RmlC:n His62:n ja His119:n protonoitumis- ja rotaameritiloille. Kuitenkin 28 reseptoria 36 reseptorista sijoittaa yli kahdeksan aktiivista ainetta 10 prosentin kärkikymmenikköön VS:ssä, kuten EF10% osoittaa (taulukko 1), mikä viittaa siihen, että useimmat reseptorit pystyvät erottamaan aktiiviset aineet ja harhautukset toisistaan, kun otetaan huomioon suurempi osa (10 %) tietokannasta. EF-tulokset viittaavat myös siihen, että reseptorimalleilla, joissa on HIP62 tai HIP119, on yleensä huono rikastuskyky, mikä johtuu todennäköisesti laajoista vetysidosverkostoista houkutteiden kanssa, kuten myöhemmin käsitellään.

Kunkin reseptorimallin vastaanottimen käyttöominaiskäyrän alapuolella oleva pinta-ala (Area under the receiver operating characteristic curve, AUC) arvioitiin, jotta voitiin raportoida mallien rikastuskyky His62:n ja His119:n erilaisten protonaatio- ja rotaamoritilojen yhteydessä. Kuten kuvasta 4a ja taulukosta 1 käy ilmi, kaikkien reseptorimallien AUC-arvot vaihtelevat välillä 0,868-0,996, mikä osoittaa kaiken kaikkiaan hyvää ennustuskykyä (AUC-arvo 0,5 vastaa sitä, että aktiivien ja harhautusten välillä ei ole eroa). Yleisesti ottaen AUC-tulos täydentää reseptorien ennustuskyvyn EF-arviointia. Yhteenvetona taulukosta 1 kuvasta 4c nähdään, miten reseptorin suorituskyvyn vaihteluväli riippuu kahdesta histidiinin protonoitumis- ja rotaameritilasta. Kun otetaan huomioon AUC:n 25-75 prosentin vaihteluväli (kuva 4c, merkitty paksummilla viivoilla), His62-malleissa on suurempi vaihtelu His119-tilojen välillä. His119-mallien suorituskyky on sitä vastoin johdonmukaisempi riippumatta His62:n protonoitumistiloista, lukuun ottamatta HIP-tilaa. Tämä osoittaa, että His62:n eri protonoitumistiloilla on pienempi vaikutus kuin His119:n tiloilla reseptorin suorituskykyyn seulonnassamme.

Rikastumisen voimakkaampi riippuvuus His119:n protonoitumistiloista havaitaan HIE62- ja HIP62-malleissa. HIE62-tilalla käännetyn HIP119:n (malli 6) ja käännetyn HIE119:n (malli 2) sisältävät mallit tuottavat parhaan reseptoritehon. Mallit 3 ja 5, joissa on HID119 ja HIP119, johtavat vastaavasti huonoimpaan rikastumiseen. Tutkittaessa, miksi HIE62-tilalla on suurin vaihtelu AUC-arvoissa, havaitaan, että His62:lla on joko pi-pi- pinoutumista tai ei lainkaan vuorovaikutuksia ligandien kanssa ja se muodostaa vain muutamia vetysidoksia korkea-arvoisten houkutteiden kanssa. Näin ollen reseptorin suorituskyky riippuu His119:n vuorovaikutuksesta dekoyttien kanssa. Tämä nähdään myös tarkasteltaessa HIP62-mallien AUC-arvojen laajaa suorituskykyaluetta. Vetysidosverkostoja houkutteiden kanssa käsitellään myöhemmin seuraavassa jaksossa.

Reseptorimalliparin AUC-arvojen eron tilastollisen merkitsevyyden arvioimiseksi suoritimme 95 prosentin tasolla kaksipuolisen p-testin nollahypoteesille, jonka mukaan parin AUC-arvot ovat tilastollisesti vertailukelpoisia, vastakohtana vaihtoehtoiselle hypoteesille, jonka mukaan niiden AUC-arvojen ja ennustuskyvyn ero on tilastollisesti merkitsevä. Tulos on esitetty online-resurssitaulukossa 1, ja alle 0,05:n p-arvoja korostetaan. Reseptoreilla on keskimäärin yli 16 p-arvoa, jotka ovat alle 0,05, mikä osoittaa VS:n herkkyyden histidiiniprotonoitumiselle ja rotameerisille tiloille. Kuten voidaan odottaa, reseptorit, joilla on merkittävimmät erot, vastaavat malleja, joilla on korkeimmat (malli 6) tai alhaisimmat AUC-arvot (mallit 3, 29 ja 5). Malli 6 on tilastollisesti parempi asettamaan aktiiviset reseptorit paremmuusjärjestykseen kuin 26 muuta reseptorikokonaisuuden reseptoria. Mallit 3, 29 ja 5 ovat erottuvasti huonompia sijoittamaan aktiiviset aineet paremmuusjärjestykseen kuin 29, 25 ja 31 muuta reseptoria.

Vetysidosvuorovaikutusten kvantitatiivinen analyysi tehtiin kunkin VS-tuloksen ylimmälle 1 %:lle (20 telakoitua yhdistettä), jotta otettaisiin huomioon runsaat vetysidosvuorovaikutukset sitoutumiskohdan jäännösten kanssa, joita havaittiin usein houkutusaineilla. Tulokset osoittavat käänteistä korrelaatiota vetysidosten osuuden ja reseptorin suorituskyvyn välillä. Kuvassa 4b esitetään kunkin reseptorimallin keskimääräinen vetysidospitoisuusprosentti 1 %:n parhaista telakoituneista yhdisteistä. Vetysidosprosentti määritellään Glide XP:n vetysidostermin osuutena telakointituloksen kokonaismäärästä. Kuvien 4a, b vertailu paljastaa käänteisen suhteen vetysidosten prosenttiosuuden ja AUC:n välillä, kun R2 on 0,42 (y = -56,18x + 67,95, korrelaatio on esitetty Online-resurssissa 4). Käänteinen suhde havaitaan yleisesti malleissa, joissa on HIP119, käänteinen HIP119 tai HID62, joissa korkea vetysidosten prosenttiosuus johti huonoon rikastumiseen. Esimerkiksi reseptorimallilla 29, jossa on HIP62 ja HIP119 ja jossa molemmat histidiinit esittävät aktiiviseen kohtaan suuntautuvia vetysidosten luovuttajia, on yksi huonoimmista AUC-arvoista johtuen vetysidosten suuresta prosenttimäärästä huipputapahtumien osumissa.

His119:n vetysidospotentiaali määrittää usein reseptorin suorituskyvyn. Esimerkiksi HID62:n ja HIP119:n sisältävä malli oli poikkeava HID62-mallien joukossa kuvassa 4c, jossa rikastuminen oli huomattavan vähäistä verrattuna muiden viiden HID62-mallin yleiseen hyvään suorituskykyyn. HID62-mallien AUC:n mediaani on korkea, 0,989, huolimatta siitä, että HID62:sta on usein vetysidoksia haitta-aineisiin. Tämä johtuu siitä, että His119-tilat saavuttavat vain vähän vetysidosvuorovaikutuksia dekoodien kanssa. Ainoastaan HIP119-tilan kanssa HID62-malli tekee vetysidoksia useiden houkutinmateriaalien kanssa, mikä johtaa suhteellisen alhaiseen AUC-arvoon. Tämä havainto sopii yhteen reseptorin suorituskyvyn voimakkaamman riippuvuuden kanssa His119:n protonoitumistiloista, kuten edellä on käsitelty. Verkkoaineisto 4 kuvaa AUC-jakaumaa ja vetysidosten prosenttiosuutta yhdessä vetysidosten luovuttajan tai hyväksyjän suunnan kanssa kahdesta reseptoriin päin olevasta histidiinistä.

Ylläolevat analyysit korostavat houkutteisiin kohdistuvien vetysidosten haittaavaa vaikutusta VS:n ennustuskykyyn, joka johtuu kahden histidiinin erilaisista koordinaateista, joilla on erilaiset protonoitumis- ja rotaamoritilat. Havaitun korrelaation hajonta, jonka R2 on 0,42, johtuu todennäköisesti useista syistä, mukaan lukien houkutusaineiston kemiallinen luonne sekä kunkin reseptorin pienet erot geometriassa minimoinnin yhteydessä proteiinin alkuperäisessä valmistuksessa. Osoittamalla selvästi virtuaalisen seulonnan tulosten herkkyyden histidiinien erilaisille protonoitumis- ja rotaameritiloille aktiivisessa keskuksessa korostamme, että reseptorin atomikoordinaatteja VS:ää varten valmisteltaessa on noudatettava huolellisuutta, erityisesti ottaen huomioon seulottavien ligandien yleiset ominaisuudet. Tähän kuuluu myös vetysidoksen huomioon ottaminen rinnakkaiskide-ligandiin ja sen vaikutus proteiinivalmisteluun sekä proksimaalisten vetysidosverkostojen kattava analyysi. Tähän päästään yleensä tarkastelemalla laajalti käytettyjen pKa-ennusteohjelmistopakettien tuloksia, ja tähän mennessä olemme vertailleet eri pakettien tuloksia suhteessa VS-tuloksiimme ja keskustelemme niistä tarkemmin.

Halkeamien telakointi

Vaihtelevat tekijät johtavat eroihin reseptoreiden välisessä sijoittumisjärjestyksessä, erityisesti halkeamien suhteen. Yleisesti ottaen aktiivisia aineita paremmalle sijalle sijoittuneet houkutteet olivat molekyylipainoltaan suuria ja niillä oli enemmän potentiaalia olla vetysidoksia reseptorin kanssa. Tässä jaksossa analysoimme tarkemmin usein esiintyviä vuorovaikutusmalleja, joita havaittiin houkutteiden ja reseptorin välillä, keskittyen reseptorimalleihin, joilla oli huono rikastuminen.

Harhut ovat yleensä molekyylipainoltaan suurempia ja niillä on enemmän rengasrakenteita kuin aktiivisilla aineilla (taulukko 2). Tämä johtaa siihen, että decoytit sijoittuvat korkeammalle, mikä johtuu hydrofobisista vuorovaikutuksista, kun reseptoriin ei ole vetysidoksia. Kuvassa 5a esitetään hydrofobiset vuorovaikutukset, jotka on saavutettu suuren inaktiivisen yhdisteen 16952387 avulla reseptorimallissa 19. Tämä yhdiste sijoittuu usein viiden parhaan joukkoon monissa VS-ajoissa, koska sillä on merkittäviä pi-pi-pinointivuorovaikutuksia Phe26:n, Tyr132:n ja Tyr138:n kanssa. Tämä suuntaus on usein havaittavissa virtuaalisessa seulonnassa, jossa suuremmat molekyylit sijoittuvat paremmin reseptorin kanssa tapahtuvien laajojen vuorovaikutusten vuoksi.

Rikastustulos on erityisen alhainen niiden reseptorien osalta, jotka tarjoavat runsaasti vetysidosverkostoja houkutusaineille. His62:n ja His119:n kautta tapahtuvia vuorovaikutuksia ei havaittu laajalti aktiiveilla, ja siksi yhdisteet, joilla on suuremmat entalpiset kontribuutiot, sijoittuvat virheellisesti edullisemmin. Kuvassa 5b esitetty esimerkki kuvaa inaktiivisen yhdisteen 17388064 vuorovaikutusta reseptorimallissa 3 (AUC 0,868), joka sijoittuu ensimmäiseksi. Tässä reseptorissa, joka asettaa yhdisteet huonoimmin paremmuusjärjestykseen AUC:n perusteella, yhdiste 17388064 muodostaa kaksi vetysidosta kahden histidiinin kanssa, toisen sen hydroksyylivedyn ja HIE62:n δ-nitrogeenin välillä ja toisen sen hydroksyylihapen ja HID119:n δ-nitrogeenin vedyn välillä. Tällä yhdisteellä on viisi vetysidoksen luovuttajaa ja yhdeksän akseptoria, mikä on suuri määrä verrattuna dekoodien ja aktiivisten yhdisteiden vastaaviin keskiarvoihin (taulukko 2). Näin ollen tämän houkutusyhdisteen, jonka vetysidosten osuus kokonaispistemäärästä on 34,7 ± 6,62 %, havaitaan usein muodostavan vähintään yhden vetysidoksen jommankumman histidiinin kanssa ja saavuttavan siten korkeita sijoituksia useissa VS-ajoissa.

Kahdella muulla reseptorimallilla, mallilla 29, jossa on HIP62 ja HIP119, ja mallilla 5, jossa on HIE62 ja HIP119, havaitaan samanlaisia vuorovaikutusmalleja houkutusyhdisteiden kanssa kuin mallilla 3. Näillä kolmella mallilla on alhaisimmat AUC-arvot, ja niiden keskiarvo on 0,870. Kuten edellä on käsitelty, niiden AUC-arvot poikkeavat merkittävästi muista reseptoreista, mikä heijastaa His62:n ja His119:n kautta saavutettujen vetysidosten ja heikon rikastumisen välistä hienovaraista suhdetta. Lisäkuva, jossa kuvataan houkutteiden ja reseptoreiden välisiä vetysidosverkostoja, on esitetty verkkoaineistossa 5.

pKa:n ennuste His62:lle ja His119:lle

Tuloksemme osoittavat selvästi virtuaalisen seulonnan herkkyyden histidiinien protonoitumiselle ja rotaamerisille tiloille. Monissa laskennallisissa biofysikaalisissa tutkimuksissa titrattavien jäännösten protonoitumistilat määritetään erilaisten pKa-ennustusohjelmien avulla. Arvioidaksemme näiden ohjelmien suorituskykyä tunnistettaessa reseptorimallia, jolla on paras ennustuskyky telakoinnissa, vertasimme PROPKA-, Maestro-, H++- ja MCCE-ohjelmista saatuja His62:n ja His119:n pKa-ennustustuloksia, kuten taulukossa 3 on esitetty, laskettuihin pKa-arvoihin.

Ensiksi PROPKA 3.1 ennustaa, että sekä His62 että His119 ovat neutraaleja riippumatta TRH:n läsnäolosta valmistuksen aikana. Ohjelma ei kuitenkaan pysty osoittamaan histidiinien rotaamerisia tiloja. Siksi HID-, flipped HID-, HIE- tai flipped HIE-tila on määritettävä manuaalisesti. Samoin kuin PROPKA, myös ohjelma H++, joka käyttää yhden rakenteen jatkuvaelektrostaattisuutta, toteaa molemmat histidiinit neutraaleiksi, vaikka ennustetut pKa-arvot poikkeavat PROPKA:n arvoista. Ohjelma MCCE, joka perustuu monirakenteiseen kontinuumielektrostaattisuuteen, ennustaa His62:n olevan neutraali, kun taas His119:n olevan protonoitunut.

Seuraavaksi käytimme Maestron Protein Preparation Wizard -ohjelmaa laskeaksemme His62:n ja His119:n pKa:t TRH:n kanssa ja ilman sitä. Huomaa, että Maestro pystyy vaihtelemaan rotameerisia tiloja, kun taas PROPKA ei pysty. Äskettäisen päivityksen ansiosta Maestro voi käyttää PROPKAa pKa:n ennustamiseen Epikin sijaan. Epikin avulla Maestro ennustaa sekä His62:n että His119:n olevan kahdesti protonoituneissa tiloissa TRH:n läsnäolosta riippumatta. Mielenkiintoista on, että reseptorimallilla, joka vastaa tätä monihistidiinitilaa, on huonoin ennustusvoima AUC:n ollessa 0,869. Kun PROPKAa käytetään, HIP62 ja HIE119 ennustetaan proteiini-TRH-kompleksille ja HIE62 ja HIE119 apoproteiinille. Nämä kaksi Maestro-ohjelmassa PROPKA:lla tehtyä ennustetta vastaavat kohtalaisen rikastustehokkaita malleja, joiden AUC-arvot ovat vastaavasti 0,971 mallille 25 (HIP62 ja HIE119) ja 0,942 mallille 1 (HIE62 ja HIE119).

Kun otetaan huomioon, että edellä mainitut eri ohjelmistoilla tehdyt ennusteet poikkeavat merkittävästi toisistaan, on syytä noudattaa varovaisuutta käytettäessä näitä tuloksia ohjeena proteiinin valmistamiseksi virtuaaliseen seulontaan. Ilman tarkkaa tietoa reseptorin todellisesta protonoitumistilasta sekä seulottavista ligandeista on vaikea käsitellä tätä ongelmaa. Siksi ehdotamme, että tässä tutkimuksessa suoritetun kaltainen pienimuotoinen analyysi ja vertailu kokeellisiin tietoihin, jos niitä on saatavilla, voisi tarjota tarkemman kuvauksen proteiinireseptoreiden titrattavissa olevien jäännösten protonoitumis- ja rotaameritiloista tulevia laajempia seulontoja varten. Vaihtoehtoisesti malli, joka sisältää vaihtoehtoisten sivuketjujen protonoitumis- ja rotaameriatilojen eksplisiittisen sisällyttämisen telakoinnin aikana, mahdollisesti siten, että tiedot tallennetaan ruudukkoon, kuten Glide-ohjelmassa on olemassa pyöriville hydroksyyleille ja tioleille, voi olla tavoittelemisen arvoinen. Tulosten tarkastelu protonoitumistilojen ja histidiinien kanssa tapahtuviin vuorovaikutuksiin perustuvien sijoitusten osalta olisi tutkittava huolellisesti ennen kokeelliseen testaukseen siirtymistä.

Lisäksi reseptorin joustavuus vaikuttaa todennäköisesti ionisoituvien jäännösten protonoitumistiloihin. Vaikka tätä ei tässä nimenomaisesti tutkittu, kunkin reseptorin minimointia lukuun ottamatta protonoitumistilojen määrittämisen jälkeen, proteiinin joustavuus on selvästi tärkeä lääkkeiden suunnittelun ja kehittämisen kannalta . Konformaatio- ja protonaatioavaruuden samanaikaisesta tarkastelusta tulee nopeasti hankalaa tässä kuvatun kaltaisilla fysikaalisilla menetelmillä, mutta tehostetut näytteenottomenetelmät ovat lupaavia tällaisten vaikeuksien ratkaisemiseksi . Tällaisia menetelmiä ovat esimerkiksi vakio-pH-molekyylidynamiikkasimulaatiot, joissa pH on ulkoinen termodynaaminen muuttuja, jota käytetään titratoituvien jäännösten pKa-arvojen sokeaan ennustamiseen . Näiden simulaatioiden tulosten tehokas soveltaminen molekyylisuunnitteluun on jatkuva kiinnostuksen kohde. Tällaisista simulaatioista saatuja tasapainokokonaisuuksia voidaan käyttää yhdessä telakoinnin kanssa sovelluksena rennosta monimutkaisesta järjestelmästä, jossa virtuaalinen seulonta suoritetaan eri tavoin protonoitujen rakenteiden kokonaisuudella rikastustulosten parantamiseksi . Reseptorin joustavuuden huomioon ottaminen kohteen valmistelussa johtaa laajempaan näytteenottoon konformaatio- ja protonaatioavaruudesta, mikä parantaa VS:n suorituskykyä.