Abstract
On osoitettu, että ihmisen immuunikatoviruksen tyyppi 1:n (HIV-1) replikaatio säilyy useimmilla infektoituneilla henkilöillä, jotka saavat pitkäkestoista erittäin aktiivista antiretroviraalista hoitoa (HAART). Tutkimuksia, joissa tarkastellaan jatkuvan viruksen replikaation alhaisen tason ja immunologisten parametrien, kuten CD4+:CD8+ T-solujen suhteen, välistä suhdetta tällaisilla henkilöillä, on kuitenkin puuttunut. Tässä tutkimuksessa osoitetaan tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin ja CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvun välillä infektoituneilla henkilöillä, jotka saivat HAART-hoitoa ja joilla plasman viremia oli suppressoitu alle havaitsemisrajan pitkäksi aikaa. HIV-1-spesifisten sytotoksisten CD8+ T-lymfosyyttien (CTL) frekvenssin ja CD4+ :CD8+ T-solujen suhteen välillä ei havaittu korrelaatiota näillä henkilöillä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että jatkuva, matalan tason jatkuva viruksen replikaatio, vaikka se ei riitäkään ylläpitämään HIV-1-spesifisiä CTL-vasteita, saattaa osittain selittää sen, miksi CD4+ :CD8+ T-solujen suhdelukua ei saada normalisoitua joillakin tartunnan saaneilla henkilöillä, joita on onnistuneesti hoidettu HAART-hoidolla.
Korkea-aktiivisen antiretroviraalisen hoidon (HAART) käyttö ihmisen immuunikatoviruksen tyypin 1 (HIV- 1) infektoituneiden henkilöiden hoidossa on muuttanut dramaattisesti monien infektoituneiden henkilöiden kliinistä hoitotulosta, ja se on johtanut AIDSin esiintyvyyden ja kuolleisuuden huomattavaan vähenemiseen . Useimmilla tartunnan saaneilla henkilöillä, joilla plasman viremia on laskenut alle havaitsemisrajan, on kuitenkin todettu olevan replikaatiokykyistä virusta, HIV-1-proviraalista DNA:ta (mukaan lukien 2 pitkää terminaalista toistoympyrää), splikoitunutta ja splikoimatonta HIV-1-RNA:ta CD4+ T-soluissa sekä tunnistamattomia virusreservoareja, ja nämä jatkuvan replikaation lähteet ovat osoittautuneet suurimmaksi esteeksi HIV-1:n hävittämisen estämisessä.
HaART-hoidon aloittamisen jälkeen plasman viremia laskee nopeasti alle havaitsemisrajan suurella osalla tartunnan saaneista henkilöistä, ja sitä seuraa CD4+ T-solujen määrän asteittainen lisääntyminen ja CD8+ T-solujen määrän väheneminen. CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukujen normalisoitumista ei kuitenkaan saavuteta joillakin tartunnan saaneilla henkilöillä, jotka ovat muuten menestyksekkäästi vastanneet HAART-hoitoon. Tältä osin on ehdotettu, että kroonisesti kohonneet CD8+ T-solujen määrät tai epänormaalit CD4+:CD8+ T-solujen suhteet perifeerisessä veressä johtuvat aktiivisesta viruksen replikaatiosta infektoituneilla henkilöillä, joita ei ole hoidettu tai jotka saavat epäoptimaalista viruslääkehoitoa . Lisäksi CD8+ T-solujen aktivoitumisen merkkiaineen CD38:n ilmentymisen on osoitettu olevan taudin etenemisen ennusteellinen merkkiaine . Vaikka on esitetty, että CD4+:CD8+ T-solujen suhteen normalisoitumattomuus joillakin HAART-hoitoa saavilla potilailla johtuu viruksen replikaation epätäydellisestä tukahduttamisesta, ei ole raportoituja tietoja, jotka käsittelisivät tätä kysymystä suoraan, varsinkaan potilailla, jotka ovat saaneet HAART-hoitoa pitkään ja joilla plasman viremia on tukahdutettu hyvin.
On todettu, että infektoituneiden CD4+ T-solujen reservoari perifeerisessä veressä, joka määritetään HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien solujen lukumäärän perusteella, säilyy jatkuvan virusreplikaation ansiosta jopa hyvin alhaisilla tasoilla . Tässä tutkimuksessa arvioimme CD4+:CD8+ T-solujen lukumäärän suhteen ja puhdistetuissa CD4+ T-soluissa HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin sekä HIV-spesifisten sytotoksisten CD8+ T-lymfosyyttien frekvenssin välistä suhdetta infektoituneilla henkilöillä, jotka olivat saaneet HAART-hoitoa pitkään ja joilla plasman viremia oli suppressoitunut alle havaitsemisrajan tavanomaisilla määrityksillä määritettynä.
Potilaat ja menetelmät
CD4+ T-solujen eristäminen. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) saatiin ficoll-hypaakkitiheysgradienttisentrifugoinnilla. CD4+ T-solut eristettiin HIV-1-infektoituneiden henkilöiden PBMC:stä käyttäen pylvääseen perustuvaa solujen erottelutekniikkaa (Stem-Cell Technologies), kuten muualla on kuvattu.
Kvantitatiivinen reaaliaikainen HIV-1 DNA PCR. HIV-1-provirusta kantavien CD4+ T-solujen esiintymistiheyden määrittämiseksi infektoituneilla henkilöillä suoritettiin reaaliaikainen PCR jäljempänä kuvatulla tavalla. Genominen DNA eristettiin 1-2 × 106 puhdistetusta CD4+ T-solusta Puregene DNA isolation kitillä (Gentra) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA:ta (1 µg) käytettiin sitten templaattina reaaliaikaista PCR:ää varten iCycler-laitteessa (Bio-Rad). Monistusreaktio tehtiin kolmena kappaleena käyttäen 0,5 µM alukkeita, 0,2 µM fluoresoivaa koetinta, 0,8 µM dNTP:tä, 5 µM MgCl2:ta ja 2,5 U Platinum Taq polymeraasia (Life Technologies) 50 ml:n kokonaistilavuudessa. Alukkeita 5′- GGTCTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (5′ aluketta) ja 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (3′ aluketta) käytettiin yhdessä fluoresoivan koettimen 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGTGCCCGTCTCTGTTTAMRA- 3′ kanssa. PCR-olosuhteet koostuivat denaturointivaiheesta 95 °C:ssa 3 minuutin ajan, jota seurasi 45 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 °C:ssa ja 1 minuutti 58 °C:ssa. Sarjallisesti laimennetulle ACH-2-DNA:lle tehtiin myös edellä mainittu PCR vakiokäyrien saamiseksi.
HIV-1-spesifisten CD8+ T-solujen virtaussytometrinen analyysi. HIV-1:lle spesifisten CD8+ T-solujen frekvenssi määritettiin analysoimalla solunsisäiset interferoni (IFN)-γ-positiiviset solut sen jälkeen, kun niitä oli stimuloitu HIV-1-spesifisillä peptideillä (20 mer, jotka ovat päällekkäin 15 aa). Koko HIV-1:n gag-, pol-, env- ja nef-sekvenssit kattavien päällekkäisten peptidien pooleja (1 µg kukin; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) inkuboitiin aluksi 3 × 106 PBMC:n kanssa 10 minuutin ajan 5 ml:n pyöreäpohjaisessa 5 ml:n putkessa (Becton Dickinson) 0,1 ml:n täydellisessä elatusaineessa 37 °C:n hiilidioksidipohjaisessa inkubaattorissa. Seuraavaksi putkeen lisättiin 0,4 ml täydellistä elatusainetta, ja 2 tunnin inkubaation jälkeen elatusaineeseen lisättiin Brefeldin A:ta (Sigma) lopullisena pitoisuutena 10 mg/ml IFN-γ:n erityksen estämiseksi. 6 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin kahdesti, kiinnitettiin 1 × kiinnitysliuoksella (Becton Dickinson) 10 minuutin ajan huoneenlämmössä ja pestiin uudelleen. Solut permeabiloitiin 1 × permeabilointiliuoksella 2 (Becton Dickinson), ja niitä inkuboitiin edelleen huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Kun solut oli pesty uudelleen, ne värjättiin seuraavilla vasta-aineilla: fluoresiini-isotiosyanaatti-konjugoitu anti-CD8, fykoterytriini-konjugoitu anti-IFN-γ, peridiini-klorofylliproteiini-konjugoitu anti-CD69 ja allofykosyaani-konjugoitu anti-CD3-vasta-aine (Becton Dickinson). CD3+CD8+ -lymfosyyttien portilla kerättiin ~100 000 tapahtumaa FACSCaliburilla (Becton Dickinson), ja IFN-γ + CD69+ -solujen frekvenssi määritettiin Cellquest-ohjelmistolla (Becton Dickinson).
Tilastollinen analyysi. Spearmanin järjestyskorrelaatiota käytettiin korrelaation mittarina 1) HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin ja CD4+- ja CD8+ T-solujen lukumäärän sekä CD4+:CD8+ T-solujen suhteen ja 2) HIV-1-spesifisten CTL:ien frekvenssin ja CD4+- ja CD8+ T-solujen lukumäärän, CD4+:CD8+ T-solujen suhteen ja HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen lukumäärän välillä. Fisherin tarkkaa testiä käytettiin CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukujen ⩾1,0 tai <1,0 ja CD4+ T-solujen proviirikuormituksen välisen yhteyden määrittämiseksi. Bonferroni-menetelmää P-arvojen mukauttamiseksi monitestausta varten sovellettiin CD4+ ja CD8+ T-solujen lukumäärän ja CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvun ja HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin välisiin korrelaatioihin, ja sitä sovellettiin CD4+ ja CD8+ T-solujen lukumäärän, CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvun ja HIV-1-proviraalisen HIV-1-dna:n tasojen korrelaatioihin HIV-1-spesifisten CTL:ien frekvenssillä CD4+ T-solukompartimentissa.
Tulokset
Hiv-1:n CD4+ T-soluvaraston koon ja immunologisten parametrien välinen korrelaatio. Tutkiaksemme HIV-1:n perifeerisen veren CD4+ T-solureservoarin koon ja poikkeavien perifeeristen immunologisten parametrien välistä yhteyttä infektoituneilla henkilöillä, jotka saivat menestyksekästä HAART-hoitoa pitkään, pyrimme selvittämään korrelaatioita HIV-1:n proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin ja CD4+- ja CD8+ T-solujen lukumäärän sekä CD4+ :CD8+ T-solujen suhteen välillä. Tutkimiemme infektoituneiden henkilöiden perifeerisessä veressä oli tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin ja CD4+ T-solujen lukumäärän välillä (P = 0,02; kuva 1A). Sitä vastoin CD4+ T-solujen HIV-1-proviraalisen DNA:n kuormituksen ja CD8+ T-solujen lukumäärän välillä ei havaittu korrelaatiota (P = .34; kuva 1B). Kun nämä kaksi immunologista parametria yhdistettiin ja ilmaistiin CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukuna, havaittiin voimakas käänteinen korrelaatio näiden arvojen ja HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin välillä (P ,01; kuva 1C). Lisäksi 14:llä (74 %) 19 potilaasta, joiden CD4+:CD8+ T-solujen suhde oli ,1,0, HIV-1-DNA:n proviirikuormitus oli <1000 kopiota/µg CD4+ T-soluista peräisin olevaa genomista DNA:ta. Sitä vastoin 10:llä (77 %) 13 potilaasta, joiden CD4+:CD8+ T-solujen suhde oli >1,0, HIV:n DNA:n proviirikuormitus oli ,1000 kopiota/mg CD4+ T-soluista peräisin olevaa genomista DNA:ta (P = 0,01; kuvio 1C).
Henkilön immuunikatoviruksen tyypin 1 proviiristä DNA:ta (HI-virusta) kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin ja erilaisten immunologisten muuttujien välinen suhde. Pitkäaikaista erittäin aktiivista antiretroviraalista pitkäaikaishoitoa saavien HIV-1-infektoituneiden potilaiden erittäin rikastetuista CD4+ T-soluista eristetylle genomilliselle DNA:lle tehtiin HIV-1:n pitkälle terminaaliselle toistolle spesifinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio kohdassa Potilaat ja menetelmät kuvatulla tavalla. HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien solujen frekvenssin ja CD4+ (A) ja CD8+ (B) T-solujen lukumäärän sekä CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvun (C) välisiä korrelaatioita arvioitiin.
Henkilön immuunikatoviruksen tyypin 1 (HI-virus) proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen frekvenssin ja erilaisten immunologisten parametrien väliset suhteet. Pitkäaikaista erittäin aktiivista antiretroviraalista pitkäaikaishoitoa saavien HIV-1-infektoituneiden potilaiden erittäin rikastetuista CD4+ T-soluista eristetylle genomilliselle DNA:lle tehtiin HIV-1:n pitkälle terminaaliselle toistolle spesifinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio kohdassa Potilaat ja menetelmät kuvatulla tavalla. HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien solujen frekvenssin ja CD4+ (A) ja CD8+ (B) T-solujen lukumäärän sekä CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvun (C) välisiä korrelaatioita arvioitiin.
HIV-1-spesifisten CTL:ien frekvenssin ja immunologisten ja virologisten muuttujien välinen korrelaatio. On osoitettu, että HIV-1-spesifisten CTL:ien frekvenssi vähenee vähitellen HAART-hoidon aloittamisen jälkeen HIV-1-infektoituneilla henkilöillä, koska HIV-1-antigeenien saatavuus vähenee . Tutkimme HIV-1-spesifisten CTL:ien frekvenssin ja CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukujen välistä suhdetta infektoituneilla henkilöillä, jotka olivat vastanneet menestyksekkäästi HAART-hoitoon pidemmän aikaa. Gag-, pol-, env- ja nef-geeneistä peräisin oleviin HIV-spesifisiin peptideihin reagoivien CTL:ien frekvenssien ja CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukujen välillä ei havaittu tilastollisesti merkitsevää korrelaatiota (kuva 2). HIV-1-spesifisten CTL:ien lukumäärän ja CD4+ ja CD8+ T-solujen lukumäärän sekä HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen lukumäärän välillä ei myöskään havaittu tilastollisesti merkitsevää korrelaatiota (tietoja ei ole esitetty). Huomattavaa oli, että suuntaus oli kohti suurempaa CTL:ien määrää henkilöillä, joiden CD4+:CD8+ T-solujen suhde oli alhaisempi.
Keskusteluja
HIV-1-taudin hoidossa HAART-valmisteen laajamittainen käyttö on parantanut dramaattisesti kliinisiä tuloksia . Vaikka plasman viremia voidaan pitää havaitsemisrajan alapuolella monilla HAART-hoitoa saavilla tartunnan saaneilla henkilöillä, CD4+ T-soluissa jatkuvan viruksen matalan replikaation pysyvyys on ollut merkittävä este HIV-1:n hävittämiselle . Viruksen replikaation pysyvän alhaisen tason katsotaankin olevan tärkein tekijä HIV-1:n reservoarin ylläpitämisessä, mikä näkyy HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen esiintymistiheydessä potilailla, joiden plasman viremia on saatu HAART-hoidolla suppressoitua alle tavanomaisilla testeillä havaittavissa olevan rajan . Lisäksi suurella osalla HAART-hoitoa saavista infektoituneista potilaista on havaittu pysyvästi kohonnut CD8+ T-solujen määrä . Tässä yhteydessä on ehdotettu, että aktiivinen viruksen replikaatio on vastuussa kohonneista CD8+ T-solujen määristä ja että näiden solujen aktivoitumisen merkkiaineen CD38:n ilmentymistason on osoitettu olevan taudin etenemisen ennusteellinen merkkiaine ilman tehokasta viruslääkehoitoa .
Vapautettujen tietojen puutteesta huolimatta on spekuloitu, että HAART-hoidolla menestyksekkäästi hoidettujen tartunnan saaneiden infektoituneiden henkilöiden perifeerisessä veressä esiintyvät käänteiset CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvut johtuvat jatkuvasta vähäisestä viruksen replikaatiosta . Tässä tutkimuksessa selvitimme, johtuivatko käänteiset CD4+:CD8+ T-solujen suhdeluvut joillakin infektoituneilla henkilöillä, jotka saivat HAART-hoitoa pitkään, HIV-1:n replikaation epätäydellisestä tukahduttamisesta, mikä näkyi HIV-1:n proviraalisen DNA:n varaston koossa CD4+ T-soluissa. HIV-1-proviraalisen HIV-DNA:n jatkuva esiintyminen CD4+ T-solujen osastossa HAART-hoitoa saavilla infektoituneilla potilailla on kuvattu vakuuttavasti muualla, ja sen on ajateltu heijastavan epätäydellistä jäljelle jäävän viruksen replikaation estämistä huolimatta siitä, että plasman viremia on suppressoitunut havaitsemattomalle tasolle. Osoitimme vahvan käänteisen korrelaation HIV-1-proviraalista DNA:ta sisältävien infektoituneiden CD4+ T-solujen frekvenssin ja CD4+- ja CD8+ T-solujen suhdelukujen välillä, mikä viittaa siihen, että matalat viruksen jäännösreplikaation tasot ovat saattaneet olla osasyyllisiä epänormaaleihin CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukuihin perifeerisessä verenkierrossa.
Niinkin, kuin HIV-1-proviraalista DNA:ta sisältävien CD4+ T-solujen frekvenssillä saattaa olla suora yhteys CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukujen suhteen kanssa, myös muut tekijät voivat vaikuttaa tähän suhteeseen. Sellaiset muuttujat kuin tuntemattomien virusreservoaarien olemassaolo, jotka tukevat aktiivista viruksen replikaatiota HAART-hoidon läsnä ollessa, isännän immuunijärjestelmän poikkeavuudet, annettujen hoito-ohjelmien teho tai muut sekoittavat tekijät voivat vaikuttaa sekä CD4+: CD8+ T-solujen suhdelukuihin ja CD4+ T-solujen proviralDNA-kuormiin. Huomattavaa on, että tietomme viittaavat siihen, että jatkuva viruksen replikaatio tasoilla, joita ei voida havaita tavanomaisilla plasman viremian määrityksillä, mutta jotka ylläpitävät HIV-1:n CD4+ T-soluvarastoa, vaikka ne riittävätkin estämään CD4+:n normalisoitumisen: CD8+ T-solujen suhdelukuja tässä tutkimuksessa tutkituilla potilailla, eivät kuitenkaan riitä ylläpitämään HIV-1-spesifisiä CTL-vasteita.
Voidaan väittää, että pitkään HAART-hoitoa saavien infektoituneiden CD4+:CD8+ T-solujen suhdelukujen jatkuva epänormaali muuttuminen voi johtua myös sekä immunologisista että virologisista tekijöistä. Tältä osin on osoitettu, että ilman taudin etenemistä ja CD4+ T-solujen riittävää palautumista T-solujen kokonaishomeostaasi säilyy infektoituneilla henkilöillä CD8+ T-solujen kohonneilla tasoilla, jotka puolestaan voivat häiritä CD4+ T-solujen uusiutumista . Emme kuitenkaan havainneet korrelaatiota HIV-1-proviraalista DNA:ta kantavien CD4+ T-solujen tasojen ja CD8+ T-solujen lukumäärän välillä.
Loppujen lopuksi aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CD4+ T-solujen muodostuminen kateenkorvassa estyy vakavasti joko suorien tai epäsuorien seurausten vuoksi, jotka johtuvat aktiivisesta viruksen replikaatiosta . Tältä osin infektoituneilla henkilöillä on osoitettu vähentynyt kateenkorvan tuotanto, jota mitataan naiivien CD4+ T-solujen frekvenssillä, jotka kantavat T-solureseptorin uudelleenjärjestelyn erotuspiirejä . Vaikka ei ole selvää, infektoivatko CD4+ T-solujen esiasteet HIV-1:n kateenkorvassa, tietomme viittaavat vahvasti siihen, että viruksen replikaation epätäydellinen tukahduttaminen HAART-hoitoa saavilla infektoituneilla henkilöillä levittää infektiota edelleen CD4+ T-solujen osastoon perifeerisessä veressä, mikä johtaa HIV-1:n CD4+ T-solujen reservoirin säilymiseen.
Kiitokset
Kiitämme Paul Parksia potilaskäyntien suunnittelusta, Susan Moiria käsikirjoituksen lukemisesta ja hyödyllisistä keskusteluista sekä potilaita heidän osallistumisestaan tähän tutkimukseen.
Tutkimusprotokolla hyväksyttiin Toronton yliopiston institutionaalisessa arviointilautakunnassa ja National Institutes of Healthin National Institute of Allergy and Infectious Diseasesissa. Kaikki osallistujat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuslomakkeen.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
, ym.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, ym.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
Jr
,
ym.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, ym.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, ym.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, ym.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
Kuviot ja taulukot
Hmisen immuunikatoviruksen tyypin 1 (HIV-1) spesifisten sytotoksisten CD8+ T-lymfosyyttien frekvenssin ja CD4+:CD8+ T-solujen suhteen välinen suhde. HIV-1-spesifisten CD8+ T-solujen frekvenssi määritettiin analysoimalla solunsisäiset interferoni (IFN)-γ-positiiviset solut sen jälkeen, kun niitä oli stimuloitu gag-, pol-, env- ja nef-geeneistä peräisin olevilla HIV-1-spesifisillä peptideillä. P-arvojen saamiseksi käytettiin Spearmanin rankkorrelaatiomenetelmää.
Henkilön immuunikatovirustyypin 1 (HIV-1) spesifisten sytotoksisten CD8+ T-lymfosyyttien frekvenssin ja CD4+:CD8+ T-solujen suhteen välinen suhde. HIV-1-spesifisten CD8+ T-solujen frekvenssi määritettiin analysoimalla solunsisäiset interferoni (IFN)-γ-positiiviset solut sen jälkeen, kun niitä oli stimuloitu gag-, pol-, env- ja nef-geeneistä peräisin olevilla HIV-1-spesifisillä peptideillä. P-arvojen saamiseksi käytettiin Spearmanin järjestyskorrelaatiomenetelmää.