Kystiinin kuljetus ja kystinosiini
Kystiini kertyy kystinoottisten leukosyyttien14 ja fibroblastien lysosomeihin.44 Klorokiini ja muut lysosomaalisen proteiinien hajoamisen estäjät heikentävät kystiinin uudelleen kertymistä tyhjentyneisiin kystinoottisiin soluihin, mikä viittaa siihen, että solunsisäinen proteiinien hajoaminen on ylimääräisen kystiinin lähde.45 Normaalien ja kystinoottisten solujen kystiinipitoisuutta voidaan lisätä myös kuormittamalla niitä kystiinidimetyyliesterillä46 tai kysteiini-glutationi-seosdisulfidilla44; kystiinin poistuminen lysosomeista on kuitenkin selvästi heikentynyt kystiinillä kuormitetuissa kystinoottisissa soluissa.44,46 Kystiinin poistuminen soluista, jotka ovat peräisin nefropatiaa aiheuttavan kystinoosigeenin heterotsygoottisilta kantajilta, ei ole merkittävästi heikentynyt verrattuna villityyppisiin soluihin44. Kystiini-kystiinin vastakuljetuksen mittaaminen lysosomaalisissa granuloissa osoittaa kuitenkin selvästi sen puuttumisen homotsygoottisilla potilailla, ja heterotsygoottisten kantajien arvot ovat noin puolet normaalien kontrollisolujen arvoista.47 Viallinen lysosomaalinen kystiininkuljetus on siis kystinoosin aiheuttava vika.
Sekä potilaiden48 että heterotsygoottisten kantajien49 biokemiallinen diagnostiikka oli ratkaisevassa asemassa kystinoosigeenin hienokartoituksessa kromosomissa 17p13. Keskeinen läpimurto oli linkitetyn mikrosatelliittimarkkerin genomisten deletioiden havaitseminen, minkä jälkeen CTNS-geeni tunnistettiin pienimmän deletiointervallin sisällä.50 CTNS-geeni käsittää 12 eksonia, jotka koodaavat 367 aminohappoa sisältävää proteiinia nimeltä kystinosiini. Kystinosiini koostuu seitsemästä transmembraanidomeenista, 128 aminohapon N-terminaalista, joka sisältää seitsemän glykosylaatiokohtaa, ja 10 aminohapon sytosolista C-terminaalia. Kaikilla kystinoosin eri alatyyppejä sairastavilla potilailla näyttää olevan mutaatio CTNS-geenissä (eli toistaiseksi ei ole näyttöä geneettisestä heterogeenisyydestä). Yleisin mutaatio on 57 kilotavun deletio, joka siirtää 5′ aluetta ylävirtaan eksonista 1051,52; yli 70 prosenttia pohjoiseurooppalaista syntyperää olevista nefropatiaa sairastavista kystinoosipotilaista on homotsygoottisia tämän mutaation suhteen.52-54 Bendavid kollegoineen on kehittänyt fluoresenssi in situ -hybridisaatiokoettimet tälle suurelle deletoitumiselle, joka on ensimmäinen laatuaan lysosomaalisessa varastointisairaudessa.55 Ranskalaisessa Kanadassa56 (W138X, irlantilaista alkuperää) ja Ranskan Bretagnen provinssissa57 (splice-kohdan mutaatio eksoni 8:n lopussa) on tunnistettu erillisiä mahdollisia perustajamutaatioita. Yksi toistuva missense-mutaatio (G339R) on tunnistettu kahdessa erityisessä etnisessä populaatiossa: kahdessa sukuun kuulumattomassa perheessä, jotka ovat amis-mennoniittista syntyperää, ja viidessä sukuun kuulumattomassa perheessä, jotka ovat juutalais-marokkolaista syntyperää.58-61 CTNS:stä on tunnistettu lisäksi 50 muuta mutaatiota, mukaan luettuna ainakin kolme potilasta, joilla on mutaatioita geenin promoottorialueella.62 Potilaat, joilla on juveniili tai okulaarinen kystinoosi, ovat homotsygoottisia ”lievemmän” mutaation suhteen, joka on tyypillisesti pistemutaatio, joka ei häiritse avointa lukukehystä; vaihtoehtoisesti nämä potilaat ovat yhdistelmäheterotsygootteja lievemmän mutaation ja vaikeamman mutaation suhteen.17,59
Kystinosiini ilmentyy laajalti, ja erityisen runsaasti transkriptiota on haimassa, lihaksessa ja munuaisissa.50 Immunohistokemia antikystinosiinivasta-aineilla63 ja solujen transfektio epitooppimerkityllä komplementaarisella DNA:lla (cDNA:lla)64,65 paljastavat, että proteiini ilmentyy lysosomeissa. Odotetusti kystinosiinin ilmentyminen on erityisen voimakasta munuaisten proksimaalisessa tubuluksessa.63 Kystinosiinin lokalisoituminen lysosomaaliseen kalvoon riippuu sekä tyrosiinipohjaisesta GYDQL-lyysosomaalisesta lajittelumotiivista, joka sijaitsee C-terminaalisessa hännässä, että viidennessä inter-transmembraanisessa silmukassa olevasta YFPQA-pentapeptidistä. YFPQA-motiivi on jokseenkin ainutlaatuinen siinä mielessä, että se on harvinainen esimerkki lysosomaalisesta lajittelusignaalista, joka sijaitsee sytoplasman hännän ulkopuolella.64 Sillä näyttää olevan jonkinlainen kyky pelastaa kystinosiinin lajittelu yksinään, sillä kystinosiinimutantti, josta puuttuu GYDQL-motiivi mutta jossa on ehjä YFPQA-motiivi, lokalisoituu edelleen osittain lysosomeihin.65 Vähemmistö kystinosiinimutaatioista vaikuttaa kystinosiinin lysosomaaliseen kohdentumiseen, mikä johtuu GYDQL-motiivin primaarisesta häiriöstä tai vielä tuntemattomista vaikutuksista sekundaarirakenteeseen.66 .
Kystinosiinin toiminnallisessa karakterisoinnissa hyödynnettiin proteiinin uudelleenohjautumista plasmakalvoon mutantissa, cystinosin-.GYDQL, josta puuttuu C-terminaalinen GYDQL-motiivi.67 Cystinosin-.GYDQL toimii näin ollen H+-vetoisena kystiinikuljettajana transfektoitujen solujen plasmakalvolla. Se on erittäin spesifinen L-kystiinille; muut aminohapot, erityisesti monosulfidikysteiini, eivät ole substraatteja. Kystinosiini on kyllästettävissä ja noudattaa Michaelis-Mentonin kinetiikkaa, jonka Km kystiinille on ∼280 μM.67 Sisäänpäin suuntautuvaa kuljetusta stimuloi huomattavasti solunulkoinen happo-ulkoinen pH (kuva 14-6); transmembraanisen H+ -gradientin romahtaminen nigerisiiniä lisäämällä lopettaa kuljetuksen, mikä on johdonmukaista kystinosiinin suorittaman H+-kystiinin yhteiskuljetuksen kanssa. Lysosomaalinen kystiinikuljetus on puolestaan riippuvainen adenosiinitrifosfaatin (ATP) läsnäolosta, joka ruokkii lysosomaalista H+-ATPaasia ja ohjaa kystiinin ulosvirtausta (kuva 14-7).46,68,69
Kystinosiini-.GYDQL-konstruktiota on hyödynnetty sairauteen liittyvien missense-mutaatioiden funktionaalisessa karakterisoinnissa kystinosiinissa. Suurimmaksi osaksi kuljetus ja kliiniset fenotyypit korreloivat keskenään, ja nefropaattiseen kystinoosiin liittyvien mutaatioiden aiheuttama kuljetus häviää, kun taas jäännöstoimintaa välittävät konstruktiot, jotka ilmentävät taudin juveniiliin ja okulaariseen alatyyppiin liittyviä mutaatioita.66. Jotkin nuoruusiän kystinoosiin liittyvät mutaatiot poistavat kuitenkin kuljetuksen kystinosin-.GYDQL:n yhteydessä, mikä viittaa siihen, että näillä mutaatioilla on vähäisempi vaikutus täyspitkään kystinosiiniin, joka ilmentyy lysosomaalisissa kalvoissa; yksi mahdollisuus on, että kystinosiini on vuorovaikutuksessa lysosomaalisten valkuaisaineiden kanssa, jotka stabilisoivat näitä erityisiä mutanttimuotoja.66 Tapahtuu myös päinvastoin siten, että joillakin nefropatiaa aiheuttavilla kystinoosimutaatioilla on minimaalinen vaikutus kystinosin-.GYDQL:n välittämään kuljetukseen.66
Kystinosiinin kohdennettu deletointi hiirissä johtaa kystiinin kertymiseen useisiin elimiin, mukaan lukien munuaiset.70 Kystiinikiteiden fokaalinen laskeutuminen on havaittavissa useissa kudoksissa, mukaan lukien proksimaalisissa tubulussoluissa. Näillä hiirillä ei kuitenkaan esiinny proksimaalista tubulopatiaa, mikä viittaa siihen, että kystiinikiteiden kertyminen ei yksinään ole taudin aiheuttaja.70 Silmäpoikkeavuudet kystinosiinipuutteisilla hiirillä ovat kuitenkin hyvin samankaltaisia kuin kystinoosipotilailla. Näille eläimille kehittyy siis sarveiskalvon kystiinikidekertymiä ja verkkokalvolle depigmentoituneita laikkuja, jotka viittaavat retinopatiaan.70