CCTL4/CTLMA2:n säilyminen Anophelesissa
CTL4 ja CTLMA2 koostuvat molemmat signaalipeptidistä, lyhyestä N-terminaalisesta sekvenssistä, joka sisältää CXCXC-motiivin, ja yhdestä CTL-domeenista. Tuoreessa raportissa esitettiin, että CTL4:n ja CTLMA2:n tai niiden kofaktorien toiminta on eronnut Anopheles-heimon sisällä, ja erityisesti, että An. albimanus CTL4 ei sisällä N-terminaalisia kysteiinijäännöksiä, jotka osallistuvat disulfidisidoksiin22. Tarkastelimme ensin uudelleen CTL4:n (AGAP005335) ja CTLMA2:n (AGAP005334) ortologeja, jotka ovat lähekkäin selkä vastakkain kromosomissa 2L (kuva 1a), käyttäen Vectorbasen nykyisiä geenimalleja (helmikuussa 2019)24. Löysimme proteiineja, joilla on N-terminaalinen CXCXC-motiivi, 15/16 CTL4-ortologille, mukaan lukien An. albimanus AALB014534, ja 13/14 CTLMA2-ortologille. Suoritimme sekä CTL4:n että CTLMA2:n monisekvenssikohdistukset 10 aasialaisesta, afrikkalaisesta ja uuden maailman Anopheles-lajista (kuva 1b). Juurruttamattomat fylogeneettiset puut ovat topologialtaan lähes identtisiä, ja yhdistetyssä fylogeneettisessä puussa on kaksi symmetristä oksaa, lukuun ottamatta An. dirus -lajin asemaa suhteessa An. funestus -lajiin ja An. maculatus -lajiin.
CTL4:n ja CTLMA2:n säilyvyys Anopheles-lajissa. (a) Kaavio, joka havainnollistaa An. gambiae CTL4:n ja CTLMA2:n sijoittumista vastakkain kromosomissa 2 L. (b) Juurruttamattomat fylogeneettiset puut CTL4:lle (sininen), CTLMA2:lle (punainen) kymmenessä Anopheles-lajissa, mukaan lukien An. gambiae (violetti) ja An. albimanus (syaani). Molempien monisekvenssikohdistusten N-terminaalinen osa on esitetty siten, että konservoidut kysteiinijäännökset on korostettu keltaisella ja muut konservoidut jäännökset harmaalla. CXCXC-motiivi on konservoitunut kaikissa sekvensseissä lukuun ottamatta N-terminaaliltaan typistettyjä sekvenssejä.
Tämä tukee hypoteesia, jonka mukaan CTL4 ja CTLMA2 ovat konservoituneita Anopheles-suvun sisällä, ja puuttuvat ortologit heijastavat joidenkin genomien epätäydellistä annotointia. Tutkimme kolmen lajin genomialuetta, joilla on raportoitu CTL4-ortologi mutta ei CTLMA2-ortologia: An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380 ja An. melas AMEC014491. Kaikilla on läheinen tai päällekkäinen geeni käänteisessä orientaatiossa – ASTE002636, AMIN007379 ja AMEC088499, jotka sisältävät kaksi CTL-domeenia. An. stephensi- ja An. minimus-lajeissa toista CTL:ää edeltää CXCXC-motiivi, mikä viittaa siihen, että ne voivat olla CTLMA2-ortologeja. Aedes- ja Culex-hyttysissä tilanne on epäselvempi. CTLMA2:n ortologi, joka sisältää N-terminaalisen CXCXC-motiivin, on noteerattu Ae. albopictus -lajissa, AALF001196, ja sillä on läheinen takaperin käänteinen kahden eksonin geeni AALF001195, joka koostuu seriiniproteaasista ja CTL-domeenista. Lokakuun 2018 geenimalli Ae. aegypti -lajille sisältää CTLMA2-ortologin, jolla on N-terminaalinen CXCXC-motiivi, CTLMA14 (AAEL014382), joka on tällä hetkellä listattu CTL4-ortologiksi). C. quinquefasciatus -lajin CTLMA2-ortologi CPIJ000443 on noteerattu, mutta siitä puuttuu N-terminaalinen CXCXC-motiivi. Tämä viittaa siihen, että CTLMA2 syntyi Anophelesin ja Aedesin yhteisessä esi-isässä, kun taas CTL4 saattaa olla Anopheles-spesifinen.
Biokemiallinen karakterisointi
An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4:n ja CTLMA2:n CRD:t (Kuva S1a) ja An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Kuva S1b) ekspressoitiin hyönteissoluissa käyttäen bakulovirus-ekspressiovektorijärjestelmää (BEVS) ja puhdistettiin homogeenisiksi. Kypsän AgCTL4:n (25-177) moolimassa on 17,3 kDa ja pI 7,7. Kypsän AgCTLMA2:n (18-174) moolimassa on 17,9 kDa ja pI 4,5. Puhdistetun heterodimeerin molekyylipaino ei-pelkistävällä (NR) SDS-PAGE:lla on 35 kDa (kuva 2a), ja se eluoituu yksittäisenä piikkinä kokoekskluusiokromatografiassa (SEC), jonka näennäinen molekyylipaino on 40 kDa (kuva 2b). Monomeeriset CTL4 ja CTLMA2 näkyvät pelkistävällä SDS-PAGE:lla 17 kDa:n ja 20 kDa:n pitoisuuksina. Kuten aiemmin todettiin, CTLMA2:n kohonnut näennäinen molekyylipaino saattaa heijastaa sen epätavallista (hapanta) aminohappojakaumaa20.
Rekombinanttisen CTL4:n/CTLMA2:n biokemiallinen karakterisointi. (a) Puhdistettu An. gambiae CTL4/CTLMA2 -heterodimeeri ei-pelkistävällä (NR) ja pelkistävällä (R) SDS-PAGE:lla. Edustavat >10 riippumatonta koetta. (b) Anioninvaihto- (MonoQ 10/10) ja kokoekskluusiokromatogrammi (Superdex75 16/60) An. gambiae CTL4/CTLMA2:lle. Pienet rastit merkitsevät mukana olevia SDS-PAGE-fraktioita, suuret rastit merkitsevät SEC MW -standardeja. Edustavat >10 riippumatonta koetta. (c) α6 × His (CTL4) ja αCTLMA2 Western blotting CTL4/CTLMA2-heterodimeerin yhdeksän kysteiinimutaation osalta pelkistämättömällä (NR) ja pelkistävällä (R) SDS-PAGE:lla. Kaikissa mutanteissa heterodimeerin muodostuminen on ilmeistä, vaikkakin vähemmän tehokasta. Edustavat kolme riippumatonta koetta. (d) C(s) vs. s:n kuvaaja sedimentaationopeuden analyyttiselle ultrasentrifugoinnille 1 mg/ml CTL4/CTLMA2, 200 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,5. Havaitaan kolme kasvavan sedimentaatiokertoimen huippua, s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Edustava kolmesta riippumattomasta kokeesta. (e) CTL4/CTLMA2:n dynaaminen valonsironta pH:n suhteen. Tiedot on sovitettu pallomaiselle hiukkaselle, jonka säde kuvastaa kokojakaumaa liuoksessa. An. gambiae- tai An. albimanus CTL4/CTLMA2:n osalta ei ole havaittavissa suuntausta pH-alueella 6-9,5 joko 1 mM EDTA:ssa tai 10 mM CaCl2:ssa. Tulos yhdestä kahdesta riippumattomasta kokeesta.
On osoitettu, että An. gambiae CTL4/CTLMA2:ta vakauttaa N-terminaalisen CXCXC-motiivin kysteiinien välinen molekyylien välinen disulfidi; näiden kolmen kysteiinin mutaatio alaniiniksi kumoaa ketjujen välisen disulfidin muodostumisen20. Tarkentaaksemme ketjujen välisen disulfidin sijaintia tarkemmin rakensimme yhdeksän mutanttia, jotka sisälsivät yhden kysteiinin CTL4:n ja CTLMA2:n N-terminaalisessa CXCXC-motiivissa, ekspressoimme proteiineja yhdessä Sf9-soluissa ja teimme Western Blotting -menetelmän CTL4:n ja CTLMA2:n havaitsemiseksi. Molekyylien välinen disulfidien muodostuminen oli tehotonta, mutta se näkyi pelkistämättömässä SDS-PAGE:ssa kaikissa tapauksissa (kuva 2c).
Tämä viittaa siihen, että N-terminaalinen molekyylien välinen disulfidien muodostuminen CTL4:n ja CTLMA2:n välillä on monipuolista sen sijaan, että siihen osallistuisi kumpaankin proteiiniin tietty kysteiinijäännös. Jos molekyylien välinen disulfidien muodostus on promiscuous, CTL4/CTLMA2-heterodimeerit voisivat periaatteessa muodostaa monivalenttisia disulfidisillattuja oligomeerejä. An. gambiae CTL4/CTLMA2:n NR-SDS-PAGE:ssa ei kuitenkaan havaittu disulfidisidonnaisia oligomeereja (kuva 2a). Vastaavasti vaikka CTL4 ja CTLMA2 voivat muodostaa disulfidisillattuja homodimeerejä in vitro20 , puhdistettu tuote on ylivoimaisesti (>95 %) heterodimeeri. An. albimanus CTL4/CTLMA2:n NR-SDS-PAGE:ssa havaitaan joitakin pieniä kaistoja (~10 %) (kuva S1b), jotka saattavat edustaa homodimeerin tai oligomeerin muodostumista.
Kaikki An. gambiae CTL4/CTLMA2:n ja An. albimanus CTL4/CTLMA2:n tuotteet ovat liuoksessa polydisperssiä. Korkeamman asteen ei-kovalenttinen oligomerisaatio näkyy SEC:ssä päähuipun olkapäänä konsentraation kasvaessa, ja se on selvempi An. albimanus CTL4/CTLMA2:lla (kuva S1). Vahvistimme oligomeeristen lajien olemassaolon sedimentaationopeusanalyyttisellä ultrasentrifugoinnilla (AUC) (kuva 2d). Kun pH on 7,5, c(s)-jakaumassa havaitaan sarja lajeja, joiden intensiteetti vähenee: s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. Oligomerisaatio on riippumaton Ca2+:sta A. gambiae CTL4/CTLMA2:n osalta, mutta se lisääntyy huomattavasti Ca2+:n myötä A. gambiae CTL4/CTLMA2:n osalta. albimanus CTL4/CTLMA2:n osalta (kuva S1b), eikä se korreloi pH:n kanssa dynaamisen valonsironnan (DLS) mukaan (kuva 2e).
Kalsiumin sitominen
Kaikki CTL:t CTL4 ja CTLMA2 voivat CTL:nä sitoa kalsiumia. CTL4:n kanoniset Ca2+ -sidontajäännökset ovat kuitenkin mutatoituneet, mikä viittaa siihen, että se voi olla CTLD mutta ei C-tyypin CRD. Näin ollen mittasimme An. gambiae CTL4:n, CTLMA2:n ja An. gambiae- ja An. albimanus -lajien CTL4/CTLMA2-heterodimeerin kalsiumia sitovan affiniteetin isotermisellä titrauskalorimetrialla (ITC). Vastaavissa olosuhteissa sitoutumista havaittiin CTLMA2:lla ja CTL4/CTLMA2:lla mutta ei CTL4:llä (kuvat 3a-c). Sitoutumisvakiot ja termodynaamiset parametrit laskettiin kolmen riippumattoman kokeen tuloksista (taulukko 1). CTLMA2:n Ca2+-sitoutuminen sopii hyvin yhden paikan malliin, jossa KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. An. gambiae CTL4/CTLMA2:n affiniteetti kalsiumia kohtaan on ~40 × suurempi kuin CTLMA2:n, KD = 4,9 ± 0,5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2:lla (kuva 3d) on samanlainen affiniteetti kalsiumia kohtaan, KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Kalsiumin sitoutuminen sekä An. gambiae- että An. albimanus CTL4/CTLMA2:een oli kuitenkin alistoikiometristä (N = 0,36-0,50).
ITC:n sitoutumisisotermi kalsiumin sitoutumista varten. (a) An. gambiae CTL4, (b) An. gambiae CTLMA2, (c) An. gambiae CTL4/CTLMA2. (d) An. albimanus CTL4/CTLMA2. Proteiinipitoisuus solussa oli 100 μM, Ca2+ (CaCl2) pitoisuus ruiskussa oli 2,5 mM monomeereille, 1,25 mM An. gambiae CTL4/CTLMA2:lle, 0,8 mM An. albimanus CTL4/CTLMA2:lle. CTL4:n sitoutumista ei ole havaittavissa, CTLMA2:n sitoutuminen on heikkoa ja CTL4/CTLMA2:n sitoutuminen on tiukkaa. Edustavat kolmea riippumatonta koetta.
Glykaanisidonta
CTL4 ja CTLMA2 kuuluvat myeloidisten CTL:ien – mukaan lukien makrofagien mannoosireseptori (MMR) ja DC-SIGN – sukulinjaan, jotka muodostavat konservoituneen immuunireseptoriperheen metazoaneissa15,25. Rakenteeltaan tunnetuista CTL:istä CTLMA2:lla on 30 prosentin sekvenssi-identiteetti hiiren haaskareseptorin (SCRL, PDB ID 2OX9)26 ja sian surfaktanttiproteiini D:n (SP-D, PDB ID 4DN8)27 hiilihydraattitunnistusalueen (CRD) kanssa. CTLMA2:ssa on säilytetty Ca2+-sitoutumiseen liittyvät jäännökset glykaaneja sitovassa silmukassa ja kanoninen EPN-motiivi, joka liittyy D-mannoosin selektiivisyyteen (kuva 4a). Sitä vastoin CTL4:stä puuttuvat kaikki Ca2+-sitoutumiseen liittyvät jäännökset, mikä on johdonmukaista sen kanssa, että sitoutumista ei havaittu ITC:llä. Ainoa tunnettu CTL, jonka rakenne on rakenteeltaan huomattavan samankaltainen CTL4:n kanssa, on tekijä IX/X:ää sitova proteiini (X-bp), joka on peräisin kiinalaisen mokasinin Deinagkistrodon acutusin myrkystä (1IOD). X-bp on modifioitu CTLD, jossa glykaania sitova domeeni on korvattu pitkällä silmukalla, joka välittää dimerisaatiota tekijä IX/X:n sitoutumiskohdan luomiseksi. Näin ollen, vaikka jotkin hyönteisten CTL:t eivät vaadi kalsiumia glykaanien sitoutumiseen, on epäselvää, pitäisikö CTL4:n ylipäätään sitoa glykaaneja.
Liuoksen sirontadata ja malli CTL4/CTLMA2:lle. (a) An. gambiae ja An. albimanus CTL4:n ja CTLMA2:n sekvenssikohdistus hiiren scavenger-reseptorin CTLD:n (SCRL, PDB ID 2OX9) ja sian surfaktanttiproteiini D:n (SP-D, PDB ID 4DN8) kanssa. Identtisesti konservoituneet jäännökset on korostettu mustalla. Ca2+/glykaania sitovan silmukan jäännökset on korostettu vaaleanpunaisella. CTL4:n emäksisen silmukan 1 jäännökset on korostettu sinisellä, CTLMA2:n happaman silmukan 1 jäännökset punaisella. (b) CTL4:n (vihreä) ja CTLMA2:n (oranssi) molekyylimalli. Ca2+/glykaanin sitova silmukka korostettu vaaleanpunaisella. Disulfidisidosten kysteiinit esitetty keltaisina tikkuina. Perustuen N-terminaalisen CXC-motiivin läheisyyteen molekyylien välisen disulfidin muodostamiseksi, CTL4/CTLMA2-heterodimeerin CRD:iden todennäköinen suuntaus olisi ulospäin suuntautuvat Ca2+/glykaanin sitovat silmukat ja sisäänpäin suuntautuvat varatut silmukat. (c) A. gambiae CTL4/CTLMA2:n röntgensäteilyn pienkulmasirontakäyrä. (sisäkkäin) Guinierin kuvaaja (PRIMUS), RG = 24,5 Å. (d) P(r)-jakauma (GNOM), Dmax = 80 Å. (sisäkkäin) sovitus sirontakäyrään, RG = 25,4 Å. (e) CTL4/CTLMA2-mallit, jotka ovat tulosta kolmen tilan sovituksesta sirontakäyrään (MULTIFOXS). Yksi malli on linjassa todennäköisimmän kanssa 20:stä P(r)-jakaumaan sovitetusta ab initio-helmimallista (DAMMIF). Mittaukset ovat peräisin yhdestä kokeesta.
Määrittääksemme niiden lektiiniaktiivisuuden analysoimme CTL4:ää, CTLMA2:ta ja CTL4/CTLMA2-heterodimeeriä glykaanirakenteilla, jotka esittävät 367 uniikkia glykaanirakennetta28. Nämä tutkimukset osoittivat sitoutumista useisiin glykaaneihin (taulukko 2). CTL4:n monomeerit sitoutuivat vain neljään ja CTLMA2:n monomeerit kuuteen glykaaniin, kun taas heterodimeeri sitoi 18 eri glykaania. Yksittäisten monomeerien ja heterodimeerin sitomien ligandien välillä on huomattava ero; CTL4/CTLMA2 ei tunnistanut 3/4 (75 %) CTL4:n tunnistamista glykaaneista ja 2/6 (33 %) CTLMA2:n tunnistamista glykaaneista.
Glykaaniryhmätulosten vahvistamiseksi ja CTL:ien sitoutumispreferenssien määrittämiseksi tehtiin SPR-analyysi (taulukko 3). Lähes kaikissa vuorovaikutuksissa glykaaniarray ja SPR olivat yhtä mieltä vuorovaikutusten olemassaolosta SPR:n osoittaessa, että glykaaniarrayllä oli neljä väärän negatiivista tulosta: CTLMA2-monomeeri H-antigeenin, kondroitiinisulfaatin ja kondroitiini-6-sulfaatin kanssa ja CTL4-monomeeri kondroitiini-6-sulfaatin kanssa. Kaikki väärät negatiiviset tulokset osoittivat kuitenkin, että CTL4/CTLMA2-heterodimeeri sitoutui matriisissa.
CTL:t eivät tunnistaneet mannoosia sisältäviä glykaaneja, lukuun ottamatta CTL4/CTLMA2:n mannoosi-6-fosfaattia, huolimatta CTLMA2:ssa esiintyvästä kanonisesta EPN-motiivista. Pikemminkin tunnistetut rakenteet ovat yleensä glykosaminoglykaanien (GAG) motiiveja, jotka koostuvat glukoosin (Glc), galaktoosin (Gal) ja niiden vastaavien heksosamiinien (GlcNac ja GalNac) välisistä β1-3/β1-4-sidoksista. Galβ1-4Glc-kytkentä esiintyi 12/23:ssa (52 %) tunnistetuista glykaaneista, mukaan lukien 6/23 (26 %), jotka sisälsivät Galβ1-4GlcNacia, ja 4/23 (17 %), jotka sisälsivät keratan-motiivin Galβ1-4GlcNac β1-3Gal tai GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.
Ryhmässä esiintyi myös jonkin verran mieltymystä polymeerisiin ja sulfaattisiin glykaaneihin. CTL4:n tunnistamista neljästä glykaanista vahvin osuma oli globopentaoosille (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc); CTL4 sitoi myös HA 160 kDa:n (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n ja β1-3Glukaanin (Glcβ1-4Glc)n. CTLMA2-monomeerin tunnistamista viidestä glykaanista kolme oli sulfatoituneita, ja CTL4/CTLMA2-heterodimeeri tunnisti kondroitiinisulfaatin ja kondroitiini-6-sulfaatin, hyaluroniinihapon (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8 ja HA 160 kDa:n (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Nämä tulokset viittaavat siihen, että heterodimerisaatiolla on erillisiä ja synergistisiä vaikutuksia glykaanien sitoutumiseen.
Sekä CTLMA2 että CTL4/CTLMA2-heterodimeeri tunnistavat useita fukoosia sisältäviä sokereita, mukaan lukien sialyyli-LewisX ja sulfo-LewisA, mutta ei sialyyli-LewisA. Suurin affiniteetti sitoutumisessa havaittiin sulfo-LewisA:han, jolloin sitoutuminen CTLMA2- (106 nM) ja CTL4/CTLMA2-kompleksiin (95 nM) oli KD-arvolla ~100 nM (taulukko 3). CTL4:n korkein havaittu affiniteetti sitoutui myös sulfatoituneeseen glykaaniin, sulfo-laktosamiiniin (292 nM).
Rakenneanalyysi
Tutkittaaksemme tarkemmin CTL4:n ja CTLMA2:n rakennetta, loimme rakennemallit CTL4:stä ja CTLMA2:sta (kuva 4b) käyttäen MODELLER29-ohjelmaa, jota oli lisäksi muokattu käsin. Sekä CTL4:llä että CTLMA2:lla on CTLD:n toista kierteitä seuraava pidennetty silmukka (silmukka 1) (kuva 4a), jossa on suuri tiheys komplementaarisesti varattuja jäämiä; CTL4:n osalta emäksisiä jäämiä ja CTLMA2:n osalta happamia jäämiä. Näiden silmukan 1 jäännösten komplementaarinen sähköstaattisuus ja niiden läheisyys N-terminaaliseen CXCXC-motiiviin viittaavat siihen, että kyseessä on potentiaalinen proteiini/proteiini-rajapinta heterodimeerissä (kuva 4b), jolle luotiin hypoteettinen malli, jossa CXCXC-motiivissa on yksi disulfidisidos. Glykaani/Ca2+-sidontasilmukat ovat kuitenkin toinen mahdollinen rajapinta, kuten D. acutus X-bp:n kahdessa ketjussa havaittiin. Vaihtoehtoinen hypoteesi on, että kaksi CTL-domeenia ovat toisistaan riippumattomia, ja joustavat linkkerit yhdistävät ne molekyylien välisen hypoteesin kautta.
Testaamaan tätä hypoteesia analysoimme CTL4/CTLMA2:n liuosrakennetta pienikulmaisella röntgensäteiden sironnalla (SAXS). Kokeet tehtiin 0,5 M NaCl:ssä, 20 mM CHES pH 9,0:ssa, 0,5 mM CaCl2:ssa ja 1 % glyserolissa hiukkasten välisten vuorovaikutusten minimoimiseksi. Näissä olosuhteissa proteiinilla oli lineaarinen suhde nollakulmassa ekstrapoloidun intensiteetin ja konsentraation välillä (I0 vs. c) aina 3,1 mg/ml:n konsentraatioon asti. Puskurista vähennetty intensiteetin I vs. q käyrä (kuva 4c) lähetettiin SAXSMoW2 -ohjelmalla, jonka tuloksena saatiin RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) ja molekyylipaino MW = 39 kDa, joka on vain 11 % suurempi kuin odotettu heterodimeerin MW 35 kDa30. Laskettu Guinierin kuvaaja perustuu kuitenkin vain seitsemään datapisteeseen; sovittamalla se laajemmalle alueelle (kuva 4c, sisäkuva) saadaan RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), kun taas sovittamalla pareittain jakaantumisfunktio P(r) (kuva 4d) saadaan RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). P(r)-jakauman sovitus DAMMIF31:llä 20 ab initio-helmimallilla, joiden keskimääräinen normalisoitu rakennepoikkeama NSD = 1,0 ± 0,2. Ab initio-mallien päärunko on muodoltaan samanlainen kuin odotettu CTL4/CTLMA2-heterodimeeri.
Helmimallien päärungosta ulottuu ylimääräinen tiheys, joka voi heijastaa joko molempien proteiinien N-terminaalista sekvenssiä, mukaan lukien CXCXC-motiivi, tai CTL4/CTLMA2:n pientä populaatiota, jolla on korkeampi kiertosäde. Tämän hypoteesin testaamiseksi suoritimme SAXS-profiilin monitilamallinnuksen MULTIFOXS32 -ohjelmalla. Loimme täydellisen mallin CTL4-6xHis/CTLMA2:lle, jossa on N-terminaalinen kierteinen kierre, joka päättyy molekyylien väliseen disulfidiin CTL4 C39:n ja CTLMA2 C34:n välillä. MULTIFOXS-ohjelmalla luotiin 10 000 mallin vaihtoehdon kokonaisuus, jota voitiin verrata kokeelliseen sirontakäyrään. Ainoat joustavat jäännökset olivat CTL4 40-45 ja 178-183 (6xHis) ja CTLMA2 35-39, ja N-terminaalinen kierre toimii jäykkänä kappaleena, joka yhdistää kaksi ketjua. Paras yhden tilan malli sopi dataan χ2 = 1,13:lla, ja sen RG = 23,7 Å. Pienin χ2 = 1,07 saavutettiin kolmen tilan mallilla (kuva 4e), jossa 80 % hajonnasta tulee kahdesta kompaktista mallista, joiden RG = 22,0 Å ja RG = 23,7 Å. Nämä tiedot ovat sopusoinnussa CTL4:n ja CTLMA2:n kompaktin heterodimeerin muodostumisen kanssa.
CTL4/CTLMA2 estävät fenolioksidaasin aktivoitumista vasteena E. coli -bakteerille
CTL4 ja CTLMA2 toimivat infektioon kohdistuvan hyttysten melanisaatiovasteen estäjinä. Aiemmin raportoitiin, että CTL4:n knockdown ei johtanut fenolioksidaasin (PO) aktiivisuuden lisääntymiseen vasteena E. coli- ja S. aureus -seoksen aiheuttamaan infektioon20. Samassa tutkimuksessa todettiin kuitenkin, että dsCTL4- ja dsCTLMA2-hyttyset olivat spesifisesti herkkiä gramnegatiivisille bakteereille. Näin ollen tutkimme uudelleen CTL4- ja CTLMA2-kopioinnin vaikutusta hemolymfan PO-aktiivisuuteen vasteena ainoastaan E. coli -infektiolle (kuva 5a). Neljä tuntia E. coli -infektion jälkeen PO-aktiivisuus oli merkittävästi lisääntynyt dsCTL4- (p = 0,02) ja dsCTLMA2- (p = 0,004) hyttysillä verrattuna dsLacZ-kontrolleihin (kuva 5b). Keskimääräinen knockdown-tehokkuus CTL4:n osalta oli 93 ± 3 % ja CTLMA2:n osalta 89 ± 3 %, ja >80 % yksittäisessä kokeessa.
Rekombinantti CTL4/CTLMA2 estää fenolioksidaasi (PO) -aktiivisuutta E. coli -haasteen jälkeen (a) Koejärjestely hemolymfan PO-aktiivisuuden mittaamiseksi 4 h E. coli -haasteen jälkeen (OD 0,8). PO-aktiivisuus määritettiin mittaamalla A492 1 h sen jälkeen, kun hemolymfaan oli yhdistetty substraatti L-3,4-dihydroksifenyylialaniini (L-DOPA), kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit & Menetelmät. (b) Lisääntynyt E. coli -bakteerin indusoima hemolymfan PO-aktiivisuus dsCTL4- ja dsCTLMA2-kopioilla. *0,017, **0,0035 (n = 3, Tukeyn monivertailutesti) (c) TEP1:n (dsTEP1) samanaikainen knockdown verrattuna LacZ-kontrolliin (+BSA) kumoaa E. coli -indusoidun hemolymfa-PO-aktiivisuuden voimistumisen dsCTL4-hyttysissä. ***0,001 (dsCTL4/dsLacZ vs. dsLacZ/dsLacZ), ***0,006 (dsCTL4/dsTEP1vs. dsCTL4/dsLacZ) (n = 3, Tukeyn monivertailutesti). (d) Rekombinanttisen CTL4/CTLMA2:n (+CTLs) samanaikainen anto BSA-kontrolliin (+BSA) verrattuna kumoaa E. coli -bakteerin aiheuttaman hemolymfan PO-aktiivisuuden voimistumisen dsCTL4-hyttysissä. **0,007, ****1,8 × 10-5 (n = 3, kaksinapainen heteroskedastinen opiskelijan t-testi). Palkit edustavat keskiarvoa ± SD, p ≤ 0,05 pidetään merkitsevänä.
Plasmodium-okinetien melanisaatio CTL4/CTLMA2:n hiljentämisen seurauksena on riippuvainen LRIM117,22:sta, TEP133:sta ja SPCLIP133:sta. Koska nämä kaikki ovat TEP1:n komplementin kaltaisen immuunivasteen osia, päättelimme, että lisääntyneen PO-aktiivisuuden ilman CTL4:ää pitäisi olla TEP1-riippuvainen. Näin ollen vertasimme PO-aktiivisuuden lisääntymistä dsCTL4-hyttysissä dsTEP1:n samanaikaisen antamisen ja dsLacZ:n samanaikaisen antamisen yhteydessä (kuva 5c). TEP1:n keskimääräinen knockdown-tehokkuus oli 82 ± 9 % ja >80 % 5/6 kokeessa (64 % yhdessä kokeessa). Itse asiassa PO-aktiivisuus ei lisääntynyt merkittävästi dsCTL4-hyttysissä, kun myös TEP1 vaiennettiin. Tämä vahvistaa, että melanisaatio CTL4/CTLMA2:n puuttuessa on TEP1-riippuvainen.
Rekombinantti CTL4/CTLMA2:n ja E. coli:n samanaikainen anto kumosi merkittävästi PO-aktiivisuuden voimistumisen dsCTL4-hyttysissä verrattuna BSA:han (p = 0,007, kuva 5d). Nämä tulokset osoittavat, että CTL4/CTLMA2 on suoraan mukana PO-aktiivisuuden negatiivisena säätelijänä. DsLacZ-hyttysissä CTL4/CTLMA2 ei kuitenkaan tukahduttanut E. coli:n aiheuttamaa PO-aktiivisuutta verrattuna naudan seerumin albumiiniin (BSA). Lisäksi E. coli -bakteerin aiheuttama PO-aktiivisuus dsCTL4-hyttysissä, joihin oli samanaikaisesti ruiskutettu rekombinantti CTL4/CTLMA2:ta (dsCTL4 + CTL), oli suurempi kuin dsLacZ-hyttysissä, joihin oli samanaikaisesti ruiskutettu BSA:ta (dsLacZ + BSA). Näin ollen rekombinantti-CTL4/CTLMA2:n ruiskuttaminen ei täysin pelasta endogeenisen proteiinin menetystä.