Samuel Langhorne Clemens, syntynyt 30. marraskuuta 1835, aloitti elämänsä tavallisena poikana, mutta kun perhe muutti Missourin Floridan pikkukaupungista Missourin Hannibaliin Samin ollessa vain nelivuotias, alkoi seikkailujen ja suuren mielikuvituksen täyttämä lapsuus. Monet tämän parikymmentä vuotta myöhemmin Mark Twainiksi muuttuneen miehen kirjallisista teoksista perustuvat Mark Twainin varhaiselämään.
Mark Twainin lapsuus kului juoksentelemalla ympäriinsä poikaporukan kanssa, joka harrasti ilkikurisuutta ja hölmöilyä, joka sopi siihen toimintaympäristöön, jossa he elivät. Mississippi-joella asuminen tutustutti nuoren Twainin höyrylaivoihin, sillä ne kulkivat jatkuvasti vilkkaalla joella ylös ja alas. Twain päätti jo varhain, että hänestä tulisi luotsi yhdelle niistä valtavista laivoista, joita hän alkoi rakastaa.
Twainin isä kuoli, kun poika oli vasta kaksitoistavuotias, ja jätti perheen taloudelliseen ahdinkoon. Hänen ja hänen muiden veljiensä oli aloitettava työt jo varhain, jotta perheen perustarpeet saatiin turvattua. Kuusitoistavuotiaana Twain oli lopettanut koulunkäynnin työskennelläkseen täysipäiväisesti kirjapainon oppipoikana Hannibalissa, mutta muutamassa vuodessa hän matkusti itärannikolla freelance-kirjapainajana. Vaikka painaminen oli Twainin alkuperäinen syy kiinnostua kirjoittamisesta, joki jäi hänen sydämeensä. Hän palasi Missouriin vuonna 1857 ryhtyäkseen höyrylaivaluotsioppilaaksi, mikä oli lyhytikäinen ammatti, joka muodosti pohjan monille hänen myöhemmille bestseller-romaaneilleen ja oli lähde hänen kuuluisalle kirjailijanimelleen Mark Twain, joka tarkoittaa ”kaksitoista jalkaa tai kahta syltä” syvää viitaten laivan kuljettamiseen soveltuvaan vedenkorkeuteen.
Vaikka Mark Twain ei koskaan saanut muodollista opetusta nykyisin tunnetussa merkityksessä, äitinsä opetti häntä kotonaan, ja hän kävi satunnaisesti koulua Hannibalissa. Siitä huolimatta Twain koulutti itseään lukemalla paikallisissa kirjastoissa kaikkialla, missä hän asui, ja oppimalla muilta.
Suurin osa siitä, mitä Mark Twainin lapsuudesta ja varhaiselämästä tiedetään, on peräisin hänen kirjoittamistaan asioista. Mark Twainin Autobiography of Mark Twain Volume I -teoksessa hän kirjoittaa: ”…pojan elämä ei ole pelkkää komediaa; siihen sisältyy paljon traagista.” Twain joutui jo varhain todistamaan kuolemaa: hänen oman isänsä kuoleman lisäksi hän sai kokea kadulla tapahtuneen miehen murhan ja orjan tappamisen valvojan toimesta, jotka molemmat tapahtuivat ennen kuin hän oli kymmenenvuotias.
Samassa elämänkertomuksessa Twain havainnoi itseään äitinsä näkökulmasta: ”Äidilläni oli paljon vaivaa kanssani, mutta luulen, että hän nautti siitä”. Kuten Tom Sawyerin ja Huckleberry Finin sekä muiden seikkailujen ja vastoinkäymisten kautta todistetaan, Twainin nuori elämä oli täynnä viihdettä. Hän kertoo lukijalle, että hänen lapsuutensa oli myös täynnä kepposia, noloja tilanteita ja jopa sisarusten välistä kilpailua.
Nuorukaisen Mark Twainin perheellä ei ollut taloudellista varallisuutta tai edes vahvaa perhesidettä isän usein välttelevien tapojen vuoksi, mutta Twain löysi aina tavan pitää hauskaa ja voittaa esteet, jotka olisivat saattaneet masentaa muita nuoria miehiä.