Pienitiheyksinen lipoproteiinireseptoriin liittyvä proteiini (LRP, low density lipoprotein receptor-related protein), joka kuuluu pienitiheyksisen lipoproteiinin reseptorigeeniperheeseen, välittää monenlaisten ligandien soluunottoa. Taittuva chaperoni, 39 kDa:n reseptori-assosioitunut proteiini (RAP), joka sijaitsee erittymisreitin varhaisissa lokeroissa, estää kaikkien ligandien sitoutumisen reseptoriin ja saattaa estää ligandien ennenaikaisen sitoutumisen reseptoriin solun pinnalle kulkeutumisen aikana. Selvittääksemme reseptorin, RAP:n ja ligandien välisen vuorovaikutuksen taustalla olevia molekulaarisia vuorovaikutuksia olemme analysoineet ja määritelleet plasminogeenin aktivaattori-inhibiittori-1:n (PAI-1), kudostyypin plasminogeeniaktivaattorin (t-PA).PAI-1-kompleksien, RAP:n ja LRP:n vastaisen Fab-fragmentin Fab A8:n sitoutumiskohdat. Tätä varten olemme tuottaneet sarjan liukoisia rekombinanttifragmentteja, jotka kattavat LRP:n toisen komplementtityyppisten toistojen klusterin (C3-C10) ja sitä reunustavan epidermisen kasvutekijän toistojen (E4) aminoterminaalin (E4-C10; aminohapot 787-1165). Kaikki fragmentit ekspressoitiin stabiilisti transfektoitujen hamsterin munuaissolujen avulla ja puhdistettiin affiniteettikromatografialla. Yksityiskohtainen tutkimus ligandin sitoutumisesta fragmentteihin pintaplasmoniresonanssin avulla paljasti, että LRP:n klusterin II-domeenissa (Cl-II) on kolme erillistä Ca2+-riippuvaista ligandin sitoutumiskohtaa. t-PA.PAI-1-kompleksit sekä PAI-1 sitoutuvat Cl-II:n aminoterminaalisessa osassa sijaitsevaan domeeniin, joka kattaa toistot E4-C3-C7. Tämän alueen vieressä ja osittain päällekkäin on korkean affiniteetin RAP-sitoutumiskohta, joka sijaitsee toistoissa C5-C7. Fab A8, reseptorin pseudoligandi, sitoutuu kolmanteen Ca2+-riippuvaiseen sitoutumiskohtaan toistoissa C8-C10 Cl-II:n karboksyyliterminaalisessa päässä. Seuraavaksi tutkittiin RAP:n välittämää ligandin sitoutumisen estoa LRP:hen ja Cl-II:een. Odotetusti havaitsimme RAP:n estävän voimakkaasti t-PA.PAI-1-kompleksin ja Fab A8:n sitoutumisen LRP:hen (IC50 yhtenevä 0,3 nM), kun taas käänteisessä kokeessa kilpailu t-PA. PAI-1-kompleksien ja Fab A8:n kilpailua RAP:n sitoutumisesta LRP:hen voitiin osoittaa vain kilpailijoiden suurilla pitoisuuksilla (>/=1 mikroM). Mielenkiintoista on, että vaikka RAP:n LRP:hen ja Cl-II:een sitoutumisen tasapainodissosiaatiovakiot ovat samankaltaisia, RAP estää ligandien sitoutumisen Cl-II:een vain pitoisuuksilla, jotka ovat vähintään kaksi kertaluokkaa suurempia kuin ne, joita tarvitaan ligandin LRP:hen sitoutumisen estämiseen. Tuloksemme puoltavat malleja, joissa ehdotetaan RAP:n aiheuttamaa allosterista estoa ligandin sitoutumiselle LRP:hen, joka saattaa edellyttää reseptorin Cl-II:n ulkopuolella sijaitsevia LRP-osuuksia.