Molekulaarisen kloonauksen perustana olevien peruskäytänteiden seminaalisista keksinnöistä lähtien, on kehitetty useita kloonausstrategioita, joilla on pyritty parantamaan DNA-fragmenttien yhdistämisen helppoutta ja nopeutta. Lue molekyylikloonauksessa käytetyistä yleisimmistä strategioista tai hanki haluamasi geeni haluamaasi vektoriin helposti GenEZ™ ORF-kloonien avulla. Aloita geenisi etsiminen.
Traditionaalinen kloonaus
Traditionaalinen kloonaus, jota kutsutaan myös PCR-kloonaukseksi, edellyttää polymeraasiketjureaktion (PCR) käyttöä kiinnostavan templaattisekvenssin (tavallisesti kiinnostavan geenin) monistamiseen ja restriktiokohtien lisäämiseen sekvenssin päihin. Rajoitusentsyymejä käytetään leikkaamaan sekä kiinnostuksen kohteena olevaa mallia että kohdevektoria, ja DNA-ligaasia käytetään yhdistämään mallin ja vektorin tahmeat päät toisiinsa. Perinteinen kloonaus mahdollistaa DNA-sekvenssin joustavan manipuloinnin, mikä helpottaa lähes minkä tahansa halutun rakenteen rakentamista. Perinteisen kloonauksen edellyttämät tarkistus- ja optimointimenettelyt voivat kuitenkin olla hankalia, ja tarvittavat reagenssit voivat olla kalliita.
TA-kloonaus
TA-kloonaus on yksi yksinkertaisimmista kloonauksen muodoista. Tässä menetelmässä käytetään 5′- tymiini-ylipäätteitä sisältäviä vektoreita, joihin hyväksytään PCR-tuotteita, joihin on lisätty 3′-adenosiini-ylipäätteitä TAQ-polymeraasin amplifikaation luonteen vuoksi. TA-kloonauksen etuna on helppous ja nopeus, koska rajoitusdigestiovaihetta ei tarvita. Lisäksi TA-kloonaussarjat sisältävät reaktiopuskureita, jotka sisältävät valmiiksi sekoitetun vektorin, ligaasin ja puskurin, mikä lyhentää ligointireaktioon kuluvan ajan jopa 5 minuuttiin. TA-kloonaustekniikan haittapuolena on se, että kloonaus ei ole suuntaa-antava, eli kiinnostava geeni voidaan lisätä kohdevektoriin joko sense- tai antisense-suuntaisesti. Tavallisesti puolet myöhemmistä transformanteista sisältää geenin sense-suunnassa ja puolet antisense-suunnassa. Myrkyllisillä geeneillä transformoiduissa soluissa voi kuitenkin kaikissa näkyä antisense-suuntaisia geenejä, koska sense-suuntaisia geenejä sisältävät solut eivät selviä hengissä. Lisäksi eloonjääneet solut, jotka sisältävät myrkyllisiä geenejä, jotka ovat suuntautuneet sense-suuntaan, voivat mutatoitua koodaamaan vähemmän myrkyllistä proteiinia.
Seamless-kloonaus
Seamless-kloonaustekniikoissa ei tarvita restriktioentsyymejä. Tästä voi olla etua, kun insertin sekvenssissä on useita restriktiokohtia, jolloin on vaikeaa löytää restriktioentsyymejä, jotka eivät leikkaa kiinnostavaa geeniä kloonauksen aikana. Saumattomassa kloonauksessa hyödynnetään homologista rekombinaatiota, ja tekniikasta on olemassa lukuisia muunnelmia. Yleisesti ottaen menettelyssä inserttiin ja vektoriin lisätään PCR:n avulla noin 15 bp:n pituisia flanking-sekvenssejä. Eksonukleaaseja käytetään insertin ja vektorin sekvenssien pureskeluun, ja DNA yhdistetään rekombinaasientsyymien tai DNA-ligaasin avulla. Saumatonta kloonausta on yksinkertaistettu kehittämällä sarjoja, jotka sisältävät jo kohdevektorin ja rekombinaatioreaktiossa tarvittavien entsyymien oman sekoituksen. Esimerkiksi GenScriptin GenBuilder™ Kitillä voidaan kloonata jopa 10 kb:n inserttejä 30 minuutissa, ja sitä voidaan käyttää myös korkean läpimenon kloonausprojekteissa.
