Onko cDNA yksi- vai kaksijuosteinen ? – (09.02.2006 )

Hei,
Postasin kysymykseni muualle, mutta en saanut vastausta, haluaisin lähettää sen tänne ja, anteeksi, että se vaikuttaa tyhmältä kysymykseltä, koska olen todella hämmentynyt !
Lukaisin jostain asian, joka hämmensi minua cDNA:sta. Haluaisin tietää, onko cDNA kaksisäikeinen vai yksisäikeinen ?
Tiedän, että cDNA on mRNA:n kopio käänteisen transkriptaasin avulla, joten teoriassa se olisi yksisäikeinen, eikö niin vai olenko väärässä ?
Kiitos palautteesta

Useimmissa tapauksissa, kuten RT-PCR, 3′ tai 5′ RACE, käytämme vain yksisäikeistä cDNA:ta (ensimmäisen säikeen cDNA), kun taas cDNA:n valmistamiseksi kirjaston rakentamiseen tai RDA/SSH-analyysiin, joka saattaa tarvita ylimääräistä toisen säikeen synteesivaihetta kaksisäikeisen cDNA:n tuottamiseksi.

hi
sinun täytyy erottaa kaksi asiaa toisistaan :
cDNA on yleensä DNA-molekyyli, joka vastaa suunnilleen mRNA:n sekvenssiä. Joten se on kaksisäikeinen molekyyli, joka sisältyy plasmidiin ekspressiota varten useimmissa tapauksissa.
RT PCR : mRNA-molekyyli käänteistranskriboidaan cDNA:ksi yksisäikeiseksi. Tämän jälkeen RNaasi eliminoi mRNA-molekyylin ja saat yksisäikeisen cDNA-molekyylin. Koska seuraava vaihe on aivan klassinen PCR, yksisäikeinen on ok exp (ja ensimmäinen vaihe, joka vastaa korreloivan DNA-molekyylin toisen säikeen sysnteesiä palauttaa todellisen cDNA-molekyylin.
Oikein, cDNA on kaksisäikeinen molekyyli, mutta mukavuuden vuoksi cDNA:ta käytetään myös RTPCR:n käänteistranskriptoidun molekyylin suunnittelussa. Se olisi nimettävä puoliksi cDNA:ksi tai yksijuosteiseksi cDNA:ksi.
cDNA on lyhennetty nimi.

Vaikka useimmissa tapauksissa cDNA, lyhenne sanoista complementary DNA, määritellään yksijuosteiseksi DNA-molekyyliksi, jonka nukleotidisekvenssi on komplementaarinen RNA-molekyylin kanssa ja joka syntetisoidaan laboratoriossa mRNA:sta käänteisellä transkriptiolla…

CDNA on siis yksisäikeinen, kunnes suoritetaan PCR-reaktio ? Ok, miten tässä tapauksessa Taq DNA polymeraasi tuottaa toisen komplementaarisen säikeen yhdestä ? Kun kaksi aluketta kiinnittyy saman säikeen kummallekin puolelle, miten ne voivat tuottaa toisen säikeen (uuden komplementaarisen säikeen) ?

PCR:ssä yksi alukke sitoutuu yhteen yksisäikeiseen DNA:n osaan (siksi ensimmäinen vaihe on aina dentaturointi 94 C:ssa (tai noin), jotta kaksisäikeiset molekyylit voidaan erottaa yksisäikeisiksi. RT-reaktiosta saadun ensijuosteisen cDNA:n tapauksessa vain yksi alukke sitoutuu ensimmäisellä kierroksella…. Tämä tarkoittaa, että ensimmäinen monistuskierros RT-PCR:ssä ei ole looginen, vaan syntetisoit yksinkertaisesti cDNA:n toisen säikeen. Seuraavilla kierroksilla (kierroksesta 2 kierrokseen n) tapahtuu logaritminen monistuminen, koska sekä etu- että käänteisalukkeet sitoutuvat denaturoituun kaksisäikeiseen templaattiin.
Ensimmäisellä kierroksella käsittääkseni juuri etummainen alukke sitoutuu… Luulen, että tämä johtuu siitä, että mRNA = genomin etummainen säie ja ensimmäinen säie cDNA = mRNA:n komplementti (tai on sama kuin genomin käänteinen säie)
Kuka tahansa tarkistaisi logiikkani tässä, olen sekoittanut itseni… onko se oikein, että mRNA on genomisen DNA:n käänteisen säikeen komplementti?
ie: mRNA-sekvenssi=forward strand=5′-3′ sekvenssi gDNA:ssa (vain U:lla ei T:llä)????
HTH

Kiitos kaikille, Nyt on minulle selvempi.

Se taitaa olla niin, kyllä, kunnes introni tulee vastaan, eikö ?
Voidaan tarkistaa mikä tahansa tunnettu mRNA-sekvenssi NCBI:stä, palauttaa genomitapahtuma ja vertailla sekvenssejä, jotta nähdään, onko se totta vai ei.

Jep, se on oikein, sinun pitäisi ohittaa intronit
Kuulostaa hyvältä tavalta testata kokeilen myöhemmin jos saan tilaisuuden ja ilmoitan sinulle… mitä enemmän ajattelen sitä, mRNA sekvenssi=forward strand sekvenssi täytyy kuitenkin olla oikein…
Kiitos!