Proteiinit

Lysotsyymi oli ensimmäinen entsyymi, jonka röntgenrakenne määritettiin korkealla resoluutiolla. Tämä onnistui vuonna 1965 David Phillipsin toimesta, joka työskenteli Royal Institutionissa Lontoossa. Phillips ehdotti lysotsyymin toimintamekanismia, joka perustui pääasiassa rakennetietoihin. Phillipsin mekanismi on sittemmin saanut vahvistusta kokeellisista todisteista, kuten myöhemmin nähdään.

Lysotsyymiä esiintyy laajalti selkärankaisten soluissa ja eritteissä (mukaan lukien kyyneleet ja sylki), ja kananmunan valkuainen sisältää erityisen runsaasti tätä entsyymiä. Lysotsyymi katalysoi glykosidisidosten hydrolyysiä, jotka yhdistävät N-asetyylimuramiinihappoa (NAM) ja N-asetyyliglukosamiinia (NAG) bakteerien soluseinien polysakkarideissa. Näin se vahingoittaa soluseinän eheyttä ja toimii siten bakteereita tuhoavana aineena. NAM-NAG-sidos on esitetty kuvassa 40, ja siihen on merkitty lysotsyymin pilkkomiskohta.

Kuva 40 Osa bakteerisoluseinien polysakkaridikomponentista, jossa näkyvät vuorotellen N-asetyylimuramiinihapon (NAM) ja N-asetyyliglukosamiinin (NAG) jäämät. Tämä polysakkaridi on substraatti lysotsyymille, joka hydrolysoi glykosidisidoksen merkityssä kohdassa. (Selkeyden vuoksi ja molekyylin lineaarisen esittämisen mahdollistamiseksi osa sidoksista on esitetty siksak-muodossa.)

Lysotsyymi on suhteellisen pieni entsyymi. Kananmunan valkuaisen lysotsyymi koostuu yhdestä polypeptidistä, jonka pituus on 129 aminohappoa (kuva 41) ja Mr 14 600. Röntgendiffraktiotiedoista nähdään, että lysotsyymin rakenteessa on selvä rako (kuva 42). Aktiivinen keskus sijaitsee tässä raossa. Kuvan 41 aminohapposekvenssissä ja kuvan 42 lysotsyymin tilaa täyttävässä mallissa on korostettu ne jäännökset, jotka reunustavat substraattia sitovaa taskua taitetussa proteiinissa.

Kuva 41 Kananmunan valkuaisen lysotsyymin aminohapposekvenssi, jossa on korostettu harmaalla ne jäännökset, jotka reunustavat substraattia sitovaa taskua. Asp 52 ja Glu 35, aktiivisen keskuksen avainjäännökset, on korostettu punaisella ja keltaisella.

Kuva 42 Kananmunanvalkuaisen lysotsyymin tilantäyttömalli, jossa avainjäännökset on korostettu. Asp 52 on punaisella; Glu 35 on keltaisella; osa substraatin sitoutumistaskua reunustavista residuaaleista on esitetty harmaalla.

Lysotsyymin aktiivinen paikka on pitkä ura, johon mahtuu kuusi polysakkaridiketjun sokeria kerrallaan. Sitoutuessaan polysakkaridiin entsyymi hydrolysoi yhden glykosidisidoksista. Jos polysakkaridijakson kuusi sokeria tunnistetaan A-F:ksi, pilkkomiskohta on D:n ja E:n välissä, kuten kuvassa 40 on esitetty. Tällöin vapautuu kaksi polysakkaridifragmenttia. Kuvassa 43 on esitetty tämän reaktion vaiheet, jotka kuvataan yksityiskohtaisesti myös jäljempänä.

Kuva 43 Lysotsyymin katalyyttinen mekanismi. Huomaa, että vain katalyysiin osallistuvat avainjäännökset (Glu 35 ja Asp 52) on esitetty. Vaiheet on kuvattu yksityiskohtaisesti tekstissä. (Perustuu Phillips, 1966)

1. Sitoutuessaan entsyymiin substraatti omaksuu kireän konformaation. Jäännös D on vääristynyt (ei näy kaaviossa), jotta siihen mahtuisi -CH2OH-ryhmä, joka muuten joutuisi epäsuotuisaan kosketukseen entsyymin kanssa. Näin entsyymi pakottaa substraatin omaksumaan konformaation, joka lähentelee siirtymätilan konformaatiota.

2. Ensyymin jäännös 35 on glutamiinihappo (Glu 35), jolla on protoni, jonka se siirtää helposti glykosidisidoksen polaariseen O-atomiin. Näin substraatin C-O-sidos pilkkoutuu (kuva 43a ja b).

3. Polysakkaridin jäännös D:llä on nyt positiivinen nettovaraus; tätä reaktion välituotetta kutsutaan oksoniumioniksi (kuva 43b). Entsyymi stabiloi tätä välituotetta kahdella tavalla. Ensinnäkin läheinen aspartaattijäämä (Asp 52), joka on negatiivisesti varautuneessa karboksylaattimuodossa, on vuorovaikutuksessa oksoniumionin positiivisen varauksen kanssa. Toiseksi D-jäännöksen vääristyminen mahdollistaa positiivisen varauksen jakamisen sen C- ja O-atomin kesken. (Huomaa, että tätä varauksen jakamista atomien välillä kutsutaan resonanssiksi samalla tavalla kuin elektronien jakamista peptidiryhmän atomien välillä). Näin ollen oksoniumionin välitila on siirtymätila. Normaalisti tällainen välitila olisi hyvin epävakaa ja reaktiivinen. Asp 52 auttaa vakauttamaan oksoniumionia, mutta se ei reagoi sen kanssa. Tämä johtuu siitä, että 3 Å:n etäisyydellä reaktiiviset ryhmät ovat liian kaukana toisistaan.

4. Ensyymi vapauttaa nyt jäännös E:n siihen kiinnittyneine polysakkarideineen, jolloin syntyy glykosyyli-entsyymi-väliaine. Oksoniumioni reagoi vesimolekyylin kanssa liuotinympäristöstä, irrottaa hydroksyyliryhmän ja protinoi uudelleen Glu 35:n (kuva 43c ja d).

5. Ensiymi vapauttaa tämän jälkeen jäännös D:n siihen kiinnittyneine polysakkarideineen, ja reaktio on valmis.

Lysotsyymin katalyysin Phillips-mekanismia, sellaisena kuin se on edellä hahmoteltuna, tukevat monet kokeelliset havainnot. Erityisesti Glu 35:n ja Asp 52:n merkitys prosessissa on vahvistettu SDM-kokeilla (site-directed mutagenesis). SDM on erittäin tehokas tekniikka, jolla voidaan tutkia yksittäisten aminohappojäämien merkitystä proteiinin toiminnassa, ja sitä käsitellään yksityiskohtaisesti kohdassa 7.2. SDM:ssä käytetään rekombinantti-DNA-tekniikkaa, jolla kiinnostava jäännös korvataan valikoivasti toisella aminohapolla, jolla on ratkaisevasti erilaiset ominaisuudet. Tuloksena syntyvää proteiinia voidaan sitten testata toiminnallisesti, esimerkiksi substraatin sitoutumisen tai katalyyttisen aktiivisuuden osalta. Kun tätä tekniikkaa sovellettiin lysotsyymiin Glu 35:n korvaamiseksi glutamiinijäännöksellä (Gln), saatu proteiini pystyi edelleen sitomaan substraattia (vaikkakin heikommin), mutta sillä ei ollut katalyyttistä aktiivisuutta. Glu 35 on siis välttämätön lysotsyymin katalyyttiselle aktiivisuudelle. Kun Asp 52 korvattiin asparagiinijäännöksellä (Asn), mutanttiproteiinin katalyyttinen aktiivisuus oli alle 5 prosenttia normaalin (villityyppisen) lysotsyymin katalyyttisestä aktiivisuudesta huolimatta siitä, että mutanttimuodon affiniteetti substraattiin oli itse asiassa kaksi kertaa suurempi. Tästä seuraa, että Asp 52 on välttämätön lysotsyymin katalyyttisen aktiivisuuden kannalta. Kokeet, joissa käytettiin kemiallisia aineita, jotka muokkasivat kovalenttisesti näitä jäännöksiä vaikuttamatta merkittävästi röntgenrakenteeseen, osoittivat samalla tavoin, että ne ovat välttämättömiä katalyyttiselle aktiivisuudelle.