Fylogeneettinen analyysi
SNCA:n ja sen oletettujen paralogien evolutiiviset suhteet arvioitiin NJ- ja ML-menetelmillä (kuva 1, ks. lisäkuva S1). Synukleiiniperheen fylogeneettinen analyysi osoitti, että kaksi duplikaatiotapahtumaa on vaikuttanut tämän perheen monipuolistumiseen. Ensimmäinen duplikaatiotapahtuma on tapahtunut selkärankaisten juurella ennen tetrapodien ja teleostien jakautumista, mikä johti SNCG-paralogiin ja SNCA/SNCB:n esi-isään. Toinen monistumistapahtuma on tapahtunut sarkopterygian sukulinjan juurella, teleostikalojen (SNCA/B) erilaistumisen jälkeen, mikä johti SNCA- ja SNCB-paralogien syntyyn. On myös syytä huomata, että SNCG-proteiinien haarojen pituudet ovat pidempiä kuin kahden muun paralogin, mikä viittaa siihen, että tämä paralogi on saattanut kehittyä nopeasti verrattuna SNCA:han ja SNCB:hen. Blast-pohjaisilla kaksisuuntaisilla samankaltaisuushauilla ei löydy yhtään tämän perheen ortologia selkärangattomien joukosta, mikä vahvistaa oletusta tämän perheen selkärankaiselle spesifisestä alkuperästä (Kuva. 1, ks. täydentävä kuva S1).
Käytettiin korjaamatonta p-etäisyyttä. Käytettiin täydellisen poiston vaihtoehtoa. Oksien numerot edustavat kyseistä haaraa tukevia bootstrap-arvoja (jotka perustuvat 1000 toistoon); tässä esitetään vain arvot ≥50 %. Mittakaavapalkki osoittaa aminohapposubstituution paikkaa kohti.
Snca-geenin evoluutionopeuden vertailu sarkopterygioiden keskuudessa
Snca-geenin evoluutionopeuserojen arvioimiseksi sarkopterygioiden eri kladeissa, SNCA:n ortologit hominoidien edustavilta jäseniltä (ihminen, simpanssi, gorilla, oranki), muiden kuin hominoidien (makakki, marmosetti, orava-apina, pensasapina), muiden kuin kädellisten istukkanisäkkäiden (hiiri, koira, lehmä, elefantti) ja muiden kuin nisäkkäiden tetrapodien (kana, kilpikonna, sammakko, kelikantti) edustajilta. Kullekin ryhmälle arvioitiin ei-synonyymiset (Ka/dN) ja synonyymiset substituutionopeudet (Ks/dS). Ja sitten sovellettiin z-testiä edellä mainittujen ryhmien valintarajoitteiden tarkistamiseksi.
Ka-Ks (dN-dS) -eron (dN-dS) todettiin olevan hominoidien osalta -2,241 (P = 0,014), muiden kuin hominoidien osalta -4,716 (P = 0), muiden kuin kädellisten istukkanisäkkäiden osalta -6,1777 (P = 0) ja muiden kuin nisäkkäiden tetrapodien osalta -7,085 (P = 0) (ks. lisätaulukko S1). Yleisesti ottaen Ks:ää alhaisempi Ka-arvo (Ka < Ks) viittaa negatiiviseen valintaan, eli luonnonvalinta on hävittänyt hiljaiset substituutiot, kun taas käänteinen skenaario (Ka > Ks) viittaa positiiviseen valintaan, eli edullisia mutaatioita on kertynyt evoluution aikana. Todisteet positiivisesta tai negatiivisesta valinnasta edellyttävät kuitenkin, että arvot poikkeavat merkittävästi toisistaan41,42. Z-testin avulla saadut tulokset (Ka-Ks < 0, p < 0,05) viittaavat siihen, että SNCA on poikennut neutraaliudesta evoluution aikana, mikä osoittaa negatiivisen valinnan rajoituksen allekirjoitusta sarkopterygian sukulinjassa (ks. lisätaulukko S1).
Evoluutionopeusanalyysi suoritettiin myös SNCA:n oletetuille paralogisille kopioille, eli SNCB:lle ja SNCG:lle. SNCB:n Ka-Ks (dN-dS) -eroksi todettiin -1,661(P = 0,05) hominoideilla, -4,708(P = 0) muilla kuin hominoideilla kädellisillä, -5,212(P = 0) muilla kuin kädellisillä istukkanisäkkäillä ja -2,992(P = 0,002) muilla kuin nisäkkäillä tetrapodeilla (ks. täydentävä taulukko S2). SNCG:n Ka-Ks (dN-dS) -ero tunnistettiin -1,658(P = 0,05) hominoidien osalta, -4,064(P = 0) ei-hominoidien kädellisten osalta, -5.485(P = 0) muiden kuin kädellisten istukkanisäkkäiden osalta, -6,306(P = 0) muiden kuin nisäkkäiden tetrapodien osalta ja -6,341(P = 0) kalojen (fugu, tetraodon, stickleback, medaka) osalta (ks. lisätaulukko S3). Nämä tiedot osoittavat, että SNCA:n lisäksi myös kaksi muuta synukleiiniperheen jäsentä ovat säilyneet voimakkaan puhdistusvalintapaineen alaisina analysoiduissa sarkopterygioissa.
SNCA:n domain-organisaatio
Voidaksemme saada käsityksen vertailevasta domain-organisaatiosta, SNCA-geenin täydellinen domain-annotaatio suoritettiin sisältäen sarkopterygialaisia edustavat ortologit (ihminen, hiiri, koira, kana, kelikantti) sekä paralogiset kopiot ihmisessä (SNCB ja SNCG). Annotaatio paljasti SNCA-geenin erityisen rakenteen, joka koostuu N-terminaalisesta A2-lipidiä sitovasta alfahelix-domeenista (1-60), ei-amyloidi β-komponentin (NAC) domeenista (61-95) ja C-terminaalisesta happamasta domeenista (96-140) (kuva. 2a).
(a) SNCA-proteiinin domeenin organisaatio. Kaavamainen esitys SNCA:n keskeisten toiminnallisten domeenien ja motiivien vertailevasta organisaatiosta ihmisen paralogisissa ja ortologisissa proteiineissa, jotka ovat peräisin fylogeneettisesti kaukaisilta lajeilta. Proteiinien pituudet on piirretty suunnilleen mittakaavassa. Domeenit ja motiivit on värikoodattu. (b) Ikkuna, jossa näkyvät SNCA:n negatiivisen valintarajoituksen alaiset paikat sarkopterygiaaneilla. Tulokset on tuotettu Hyphy-ohjelmalla toteuttamalla SLAC-menetelmä, joka käyttää globaalia koodonimallia ja maksimaalista todennäköisyyttä evoluutiohistorian rekonstruoimiseksi.
N-terminaalinen lipidejä sitova domeeni koostuu viidestä KXKEGV-epätäydellisestä toistosta26 , ja nämä toistot on tunnistettu erittäin konservoiduiksi analysoiduissa ihmisen SNCA:n ortologeissa ja paralogeissa lukumäärältään ja asettelultaan (kuva 2a). Tämän alueen ennustetaan muodostavan amfipaattisia α-heliksiä, ja sen katsotaan osallistuvan vuorovaikutukseen fosfolipidien kanssa26.
NAC-domeeni muodostaa SNCA:n amyloidogeenisen ytimen26. NAC koostuu GAV-motiivista, jonka konsensussekvenssi on VGGAVVTGV(66-74), ja kolmesta GXXX-alamotiivista (jossa X on jokin seuraavista: Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp, Thr, Ser tai Met)26. Analysoiduista ortologeista NAC todettiin erittäin konservoituneeksi. Sen vastaparalogisista kopioista SNCB:ssä NAC:n pituus (61-84) oli lyhentynyt, koska siitä puuttui yksi GXXX-motiivi ja KXKEGV-toisto. SNCG:ssä ei havaittu yhtään GXXX-alamotiivia. Kolmesta oletetusta paralogista GAV-motiivi esiintyi selvästi vain SNCA:ssa (kuva 2a). NAC:n katsotaan olevan erittäin välttämätön SNCA:n aggregaatiolle ja fibrilloitumiselle26. GAV:n oletetaan olevan tämän aggregaatioprosessin tunnusmotiivi25.
C-terminaalinen hapan domeeni sisältää kuparia sitovan motiivin, joka sisältää DPDNEA(119-124)-konsensussekvenssin43 , jonka havaittiin olevan erittäin konservoitunut SNCA:n analysoiduissa ortologeissa. Moninkertaisella sekvenssikohdistuksella ei havaittu tämän motiivin säilymistä SNCB:n ja SNCG:n paralogien välillä (kuva 2a). Tämä SNCA:n domeeni sisältää runsaasti happamia jäämiä ja proliinia. Tällä alueella sijaitsee myös kolme erittäin konservoitunutta tyrosiinijäämää, joita pidetään SNCA:n ja SNCB:n alaryhmän tunnusmerkkinä26. On myös ehdotettu, että kuparin sitoutuminen kiihdyttää SNCA:n aggregaatiota ja vaikuttaa sen patologisiin vaikutuksiin44.
Analysoitujen sarkopterygioiden evoluution aikana tapahtuneita linjakohtaisia substituutioita on kartoitettu ihmisen SNCA:ssa esi-isien rekonstruktiotekniikan avulla. Se luokitteli, että nisäkkäiden esi-isän juurella on tapahtunut yhdeksän substituutiota. Kaksi substituutiota tapahtui muiden kuin kädellisten istukkanisäkkäiden sukulinjan juurella ja yksi tapahtui erityisesti catarrhini-heimon (hominoidit ja vanhan maailman apinat) sukulinjassa (kuva 2a) (taulukko 1). Näistä 12:sta tunnistetusta substituutiosta viiden (S64T, G68E, N87S, L94F, V95G) todettiin rajoittuvan NAC:hen, kun taas kuusi (A101G, F107A, M112I, M113L, P129S, E132G) sijaitsi C-terminaalisessa happamassa domeenissa. Vain yksi substituutio (T53A) tunnistettiin N-terminaalialueella (kuva 2a). Tämän jälkeen analysoitiin näiden aminohapposubstituutioiden fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia, mikä osoitti, että suunnilleen kaikki evoluution aikana tapahtuneet substituutiot olivat radikaalityyppisiä lukuun ottamatta T53A:ta ja A101G:tä (taulukko 1). Tämä analyysi korostaa, että N-terminaalinen lipidejä sitova domeeni on erittäin konservoitunut analysoitujen ortologien ja paralogien välillä. Tätä havaintoa vahvisti entisestään se, että aiemmin raportoidut viisi ihmiselle ominaista mutaatiota, jotka liittyvät Familiaaliseen Parkinsonin tautiin, eli A30P3, E46K4, H50Q5, G51D6 ja A53T7, sijaitsevat fyysisesti ihmisen SNCA:ssa. Tulokset osoittivat, että nämä mutaatiot rajoittuvat nimenomaan N-terminaaliseen domeeniin, mikä puolestaan viittaa tämän alueen korkeaan konservoituneisuuteen paitsi toiminnallisesta näkökulmasta myös FPD:n patogeneesin kannalta (kuva 2a). SLAC-ikkuna-analyysin avulla näyttää siltä, että N-terminaalinen domeeni koostuu 15 negatiivisesti rajoittuneesta kohdasta, mikä puoltaa sitä, että vahvat valikoivat rajoitukset vaikuttavat tämän alueen säilymiseen sarkopterygian evoluution aikana (kuva 2b, ks. lisätaulukko S4).
SNCA:n rakenteellinen evoluutio
Tarkistaaksemme tarkemmin, miten puhdistava valinta suorittaa tehtävänsä esi-isien SNCA-proteiinien alueellisten rajoitusten määrittelyssä rakenteellisella tasolla, suoritettiin vertaileva rakennetutkimus. Ihmisen SNCA:n (1XQ8) NMR-rakenne otettiin referenssiksi ja sitä verrattiin mallinnettuihin esivanhempiin proteiineihin (kuva 3). Rakenteellisia poikkeamia tarkasteltiin RMSD-arvojen avulla (kuva 3, ks. täydentävä kuva S2A,B). Tulokset paljastivat hyvin merkittäviä näkökohtia, joita sekvenssitason vertaileva analyysi ei osannut ennakoida. Vertaileva rakenneanalyysi viittaa siihen, että SNCA:n rakenne on läpikäynyt useita siirtymiä saadakseen suosimansa konformaation. SNCA:n esivanhempien proteiinien ja 1XQ8:n päällekkäiset mallit paljastivat, että yhteinen poikkeava alue käsittää 32-58 SNCA:n N-terminaalisen lipidisidosalueen (taulukko 2). Nämä rakenteelliset poikkeamat mitattiin myös selkärangan vääntymien kvantifioinnin avulla, mikä osoitti, että SNCA:n alue 32-58 kehittyy jatkuvasti rakenteellisella tasolla huolimatta sen suuresta sekvenssikonservaatiosta (taulukko 2). Lisäksi havaittiin, että SNCA:n evoluution aikana on tehty destabiloivia substituutioita, joilla on pyritty saavuttamaan sen luontainen epäjärjestyksessä oleva konformaatio, mikä viittaa sen taustalla oleviin toiminnallisiin rajoituksiin (taulukko 1). Tämän rakenteellisen vertailun perusteella vaikuttaa loogiselta spekuloida, että SNCA:n evoluution aikana on tehty sellaisia substituutioita, jotka eivät ole ainoastaan aiheuttaneet SNCA:n epävakautta vaan myös aiheuttaneet rajuja rakenteellisia muutoksia tunnistetulla alueella. Tämä kriittinen alue (32-58) todettiin myös ratkaisevan tärkeäksi paitsi N-terminaalisen A2-alfa-kierukkadomeenin myös NAC-domeenin oikean konformaation kannalta. Elektroni- ja röntgendiffraktiotekniikoiden avulla on raportoitu, että normaali SNCA kootaan sen N-terminaalisen alueen kautta, mikä jälleen korostaa tämän alueen merkittävää roolia45.
Havaittiin merkittävää rakenteellista eroavaisuutta ihmisen SNCA:han nähden yhteisen sarkopterygian esi-isän jakautumisen jälkeen. Nisäkkäiden sukulinjan juurella on tapahtunut yhdeksän spesifistä substituutiota, jotka ovat säilyneet kädellisillä ja muilla kuin kädellisillä istukkanisäkkäillä sen jälkeen, kun ne ovat jakautuneet sarkopterygisestä esi-isästä. Kaksi substituutiota on tapahtunut nimenomaan muiden kuin kädellisten istukkanisäkkäiden sukulinjan juurella ja yksi catarrhini-spesifinen substituutio on tapahtunut nisäkkäiden yhteisestä esi-isästä tapahtuneen jakautumisen jälkeen. Ihmisen SNCA:sta (1XQ8) poikkeavat jäännökset selkärangan vääntökulmien (Φ°,Ψ°) suhteen on esitetty punaisella värillä. Rakenteellisia poikkeamia tarkasteltiin RMSD-arvojen avulla.
Huomiota herättävää on, että kaikki FPD:n patogeneesiin osallistuvat ihmisspesifiset mutaatiot sijaitsevat tällä ratkaisevalla alueella, mikä merkitsee sitä, että kaikki muutokset tällä alueella ovat haitallisia siihen kohdistuvan voimakkaan valinnan ja toiminnallisten rajoitteiden vuoksi. 1XQ8:n kanssa päällekkäin asetetut mutanttimallit havaitsivat merkittäviä siirtymiä kohti lipidejä sitovaa domeenia A30P:n ja H50Q:n kohdalla, kun taas E46K:n ja A53T:n kohdalla havaittiin merkittäviä muutoksia lipidejä sitovissa ja NAC-domeeneissa. Ainoastaan G51D:ssä havaittiin muutoksia vain NAC-alueella (ks. täydentävä kuva S4A,B). Kaikille viidelle mutaatiomallille oli yhteistä suuresti poikkeava alue 32-58. Tämän vertailevan rakenneanalyysin perusteella voidaan olettaa, että näiden viiden SNCA-mutaation primaarivaikutukset ja rooli FPD:n patogeneesissä voivat olla erilaiset niiden erilaisten rakenteellisten morfologioiden vuoksi.
Jatkossa SNCA:n ihmisen paralogien välisten rakenteellisten erojen tutkimiseksi tehtiin myös vertaileva rakenneanalyysi. Koska ihmisen SNCB:n ja SNCG:n NMR-rakenteita ei ole toistaiseksi raportoitu, niiden rakenteita mallinnettiin ottamalla referenssiksi ihmisen SNCA:n (1XQ8) NMR-rakenne, ja rakenteelliset poikkeamat arvioitiin (ks. täydentävä kuva S5A,B). Näyttää siltä, että SNCB:n ja SNCG:n rakenteet poikkeavat SNCA:sta suuresti N-terminaalisen ja NAC-domeenin kohdalla (kuva 4).
Havaittiin merkittäviä rakenteellisia siirtymiä N-terminaalisissa lipidejä sitovissa ja NAC-domeeneissa, jotka johtuivat paralogispesifisistä substituutioista. Ensimmäisen duplikaatiotapahtuman jälkeen esi-isä-SNCA/B:ssä tapahtui 19 muutosta. Toisen duplikaation jälkeen SNCB:ssä tapahtui 6 ja SNCA:ssa 12 substituutiota. Poikkeavat jäännökset verrattuna ihmisen SNCA:han (1XQ8) on värikoodattu. Rakenteelliset poikkeamat arvioitiin RMSD-arvoilla.
Analyysi SNCA:n ja SNCAIP:n coiled-coil-domeenin välisistä vuorovaikutuksista
Tämän kriittisen alueen merkityksen tarkemmaksi tutkimiseksi sen funktionaalista merkitystä selvitettiin vuorovaikutustutkimuksen avulla. Tätä tarkoitusta varten tarkasteltiin synfiliini-1:tä (SNCAIP), sillä synfiliini-1:n domeenin annotointi paljasti, että se on 919 a.a. (3745 bp) proteiini, jota koodataan 10 eksonilla17 ja joka sisältää kuusi ankyrinin kaltaista toistoa ja yhden keskeisen coiled-coil-domeenin (510-557) (kuva 5a). Biokemialliset ja NMR-tekniikat ovat vahvistaneet, että SNCAIP on vuorovaikutuksessa SNCA38:n N-terminaalisen alueen kanssa. Vaikka näiden vuorovaikutuskumppaneiden normaalia solutoimintoa ei vielä tunneta, on kuitenkin raportoitu, että SNCAIP on kehityksellisesti lokalisoitunut synaptisiin päätelaitteisiin ja että SNCA moduloi sen assosioitumista synaptisten vesikkelien kanssa. Ihmisen SNCA:n ja ihmisen SNCAIP:n coiled-coil-domeenin tärkeimpien toiminnallisten domeenien ja motiivien vertaileva organisaatio. Proteiinien pituudet on piirretty suunnilleen mittakaavassa. Domeenit ja motiivit on värikoodattu. (b) Telakoitujen kompleksien ja vetysidosvuorovaikutusten analyysi. Näytetään vuorovaikutukset sarcopterygian esi-SNCA:n ja SNCAIP:n coiled-coil-domeenin (2KES) välillä. (c) Esittävät ihmisen SNCA:n (1XQ8) ja ihmisen SNCAIP:n coiled-coil-domeenin väliset vuorovaikutukset. Vuorovaikutusjäännökset, jotka sijaitsevat kiinnostavalla alueella (32-58), on värikoodattu. (d) Esittää vuorovaikutuksen mallinnetun SNCA-A30P-mutantin ja ihmisen SNCAIP:n coiled-coil-domeenin välillä. Katkoviivat osoittavat vetysidoksia.
Kriittisen alueen roolin tutkimiseksi vuorovaikutuksessa tehtiin dokkausanalyysi. Vuorovaikutukset on tunnistettu sarkoptereiden esivanhempien, nisäkkäiden spesifisten ja muiden kuin kädellisten istukkaiden nisäkkäiden spesifisten SNCA-proteiinien välillä, mikä osoitti, että SNCA:n ja SNCAIP:n coiled-coil-domeenin välinen vuorovaikutus on kehittynyt ajan myötä eli sarkoptereiden evoluutiohistorian aikana on syntynyt sukulinjakohtaisia vuorovaikutussuhteita (Kuva 5b). Ihmiskohtaisen SNCA:n ja SNCAIP:n coiled-coil-domeenin välinen vuorovaikutusanalyysi paljasti, että katarroksien juurella on kehittynyt muutama linjakohtainen vuorovaikutus eli Lys32, Tyr39 ja Lys45 (ks. täydentävä kuva S6, ks. täydentävä taulukko S5). Mielenkiintoista on, että nämä ihmiselle (catarrhines) ominaiset vuorovaikutukset sijaitsevat tunnistetulla kriittisellä alueella, mikä vahvistaa hypoteesejamme tämän alueen rakenteellisesta ja toiminnallisesta merkityksestä ja sen keskeisestä roolista FPD:n patogeneesissä (kuva 5c).
Interaktioanalyysi ihmisspesifisen SNCA:n ja SNCAIP:n mutanttimallien välillä paljasti muuttuneita vuorovaikutusmalleja, kun taas osa villin tyypin vuorovaikutuksista säilyi myös, mikä merkitsee, että SNCA ja SNCAIP:n coiled-coil-domeenin SNCA ja SNCAIP eivät ole vuorovaikutuksessa ainoastaan normaaleilla yksilöillä, vaan myös FPD-potilailla, mutta vuorovaikutusmallien todettiin kuitenkin muuttuneen. A30P-SNCAIP:n ja E46K-SNCAIP:n telakoidut kompleksit paljastivat, että vuorovaikutukset siirtyivät kokonaan NAC-domeeniin, kun taas H50Q-SNCAIP:n ja G51D-SNCAIP:n kompleksien vuorovaikutukset, joissa oli mukana N-terminaalisia ja NAC-domeeneja, muuttuivat. Ainoastaan A53T-SNCAIP:n vuorovaikutukset rajoittuivat kokonaan N-terminaaliseen domeeniin, mutta vuorovaikutusmallin havaittiin muuttuneen. Voidaan olettaa, että vuorovaikutukset muuttuivat SNCA:n ja SNCAIP:n erilaisen vuorovaikutuskuvion vuoksi, mikä vaikuttaa niiden sitoutumisaffiniteetteihin, jotka puolestaan vaikuttavat SNCA:n aggregaatioon (kuva 5d, ks. täydentävä kuva S7, ks. täydentävä taulukko S6).