1. kesäkuuta 2016 (Vol. 36, nro 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Perustaja ja pääkirjoittaja DeeAnn Visk Consulting
Geeniterapian on murrettava soluvallit uusimatta Jerikon lankeemusta pienoiskoossa
Immunoterapiat syöpää vastaan, rokotteet uusia viruksia vastaan (tai vanhoja viruksia vastaan uusissa paikoissa) ja pyrkimykset ratkaista patogeenisiä yksittäisten solujen vikoja – kaikki pyrkivät sisällyttämään transfektioteknologiaa. Tämä tekniikka, joka käsittää erilaisia keinoja tuoda nukleiinihappoja soluihin, on erittäin lupaava, mutta siihen liittyy myös vakavia haasteita.
Nämä haasteet ovat olleet selvimmin esillä geeniterapian käyttöönotossa, jossa on ollut vaikeuksia ratkaista vaikeasti transfektoitavien solujen, elinten ja kokonaisten eläinten ongelmaa.
Tällaisia transfektiohaasteita ovat ottaneet vastaan useat bioteknologiayritykset. Esimerkiksi MaxCyte, Lonza ja Mirus Bio tarjoavat elektroporaatiota menetelmänä, joka jättää vain vähän jäämiä. Elektroporaatio ei sattumoisin sovellu kaikille eläimille, joten tarvitaan muita menetelmiä. Yksi vaihtoehtoinen tekniikka on virusinfektio. Sitä käyttävät esimerkiksi GenVecin kaltaiset yritykset.
Toinen haaste, joka koskee erityisesti virustransfektiota, on mahdollinen immuunivasteen stimulointi. Tämä mahdollinen negatiivinen asia voi kuitenkin olla todellinen positiivinen asia oikeassa yhteydessä, joka sattuu olemaan rokotekehitys. Virustransfektiomenetelmien hyödyntäminen rokotusmekanismien tehostamiseksi on Thermo Fisher Scientificin erikoisalaa. Yritys tarjoaa myös perinteistä kemialliseen transfektioon perustuvaa transfektiota, joka toimii koko eläimessä.
Kokonaisuudessaan tähän mennessä mainitut yritykset tarjoavat tekniikoita, jotka kattavat kaikki tärkeimmät terapeuttisesti merkitykselliset transfektiotavat: kemialliseen transfektioon perustuva transfektio, ei-kemialliset menetelmät (pääasiassa elektroporaatio) ja virustransduktio. Myös hybridilähestymistapoja kehitetään parhaillaan, kuten seuraavissa kappaleissa käy ilmi.
Elektroporaatio
MaxCyten elektroporaatioalusta on GMP-vaatimusten mukainen ja saumattomasti skaalautuva tutkimuksesta kaupalliseen mittakaavaan. ”Virtauselektroporaatiojärjestelmämme mahdollistaa miljoonasta useisiin satoihin miljardeihin soluihin ulottuvan solutransfektion alle 30 minuutissa täysin automatisoidussa suljetussa järjestelmässä”, selittää Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. ”Järjestelmämme on sekä ISO 9000:n että FDA:n vaatimusten mukainen, joten se soveltuu helposti terapeuttisen tason valmistuksen tarpeisiin.”
”Teemme rutiininomaista yhteistyötä lääke- ja biotekniikkayritysten kanssa kehitellessämme ex vivo -muotoiltuja immuuni- ja kantasoluhoitoja. Joskus tavoitteena on valmistaa nopeasti rokotteita ja korkeatuottoisia biologisia lääkkeitä, kuten vasta-aineita. Toisinaan taas annamme asiakkaillemme mahdollisuuden tuottaa suuren mittakaavan korkeatitterisiä virusvektoreita suspensio- ja adherenttisoluilla. Tämä ei ainoastaan auta terapeuttisessa kehityksessä, vaan se voi myös nopeuttaa lääkekeksintösovelluksia.”
Tämä kyky käsitellä soluja suurina tai pieninä määrinä antaa tutkijoille mahdollisuuden kehittää prosessiprotokollaa virtauselektroporaation avulla pienille solumäärille. Tämän prosessin skaalaaminen on sitten saumatonta ilman laadun ylläpitoon liittyviä tavanomaisia päänvaivoja, koska transfektioprosessi pysyy samana.
”Tämä riskien vähentäminen on erittäin houkuttelevaa kumppaneillemme. Yhdenmukaisuuden varmistaminen tutkimuksesta klinikkaan, kaupalliseen mittakaavaan ja ajosta toiseen, luovuttajasta luovuttajaan ja potilaasta potilaaseen on kriittisen tärkeää, jotta hoitoja voidaan ohjata tehokkaasti kehitysprosessin läpi”, tohtori Peshwa vakuuttaa.
Kemialliset ja lipidimenetelmät toimivat hyvin tutkimuksessa, jossa käytetään vakiintuneita solulinjoja, mutta primäärisolujen transfektoinnilla on usein odottamattomia seurauksia. Lisäksi näitä perinteisiä kemiallisia keinoja solujen transfektointiin on vaikea skaalata teolliseen tuotantoon.
Elektroporaatio, MaxCyten käyttämä ei-viruksellinen lähestymistapa, mahdollistaa transfektoitujen solujen biologian säilymisen luonnollisemmassa tilassa missä tahansa mittakaavassa. Ennaltaehkäisemällä tahattomat seuraukset transfektioprosessin aikana MaxCyten teknologia voi välttää tiesulkuja ja ratkaista samalla korkean transfektiotehokkuuden tarpeen.
”Näillä terapeuttisilla toimenpiteillä on oltava käytännössä taattu, että niillä on minimaalinen tahaton negatiivinen vaikutus muokattaviin soluihin – kaiken biologian on oltava samanlaista prosessin jokaisessa vaiheessa”, tohtori Peshwa korostaa. ”Lisäksi virtauselektroporaatiojärjestelmäämme voidaan käyttää automatisoidusti. Sitä käytetään jo rutiininomaisesti Japanissa kaupallisissa terapeuttisissa hoidoissa, ja se on eri vaiheissa eri puolilla maailmaa.”
Toinen näkökohta on se, missä transfektio tapahtuu. Kuljetetaanko potilaalta kerätyt solut toiseen kaupunkiin käsiteltäviksi? Mitä tapahtuu, jos paketti katoaa tai viivästyy tai kokee lämpötilan vaihteluita? MaxCyten tarjoama alusta tarjoaa mahdollisuuden kehittää uusia terapeuttisia lääkkeitä käsittelemällä potilaiden soluja paikan päällä, jolloin ohitetaan muihin menetelmiin liittyvät merkittävät logistiikka- ja COGS-ongelmat (cost of goods sold).
Solujen suunnittelu on ratkaisevan tärkeää solupohjaisten terapeuttisten lääkkeiden kehittämisessä. MaxCyten elektroporaatiojärjestelmällä voidaan yhtiön mukaan välttää solujen fenotyypin tahaton muuttaminen ja samalla täyttää solutekniikan haasteiden keskeiset tarpeet: tehokkuus, johdonmukaisuus, siirrettävyys ja skaalautuvuus.
Virustransduktiot
Virusvektorit ovat erityisen käyttökelpoisia, kun halutaan tehdä transfektioita koko eläimelle tai käyttää kudoksissa, joita voi olla vaikea tavoittaa kemiallisilla tai elektroporaatiomenetelmillä. GenVec on erikoistunut virusvektoreiden, erityisesti adenoviruksen, käyttöön geenien välittämisessä terapeuttisiin tarkoituksiin.
”Ensisilmäyksellä virusvektoreiden immuunivasteeseen liittyvät ongelmat vaikuttavat ongelmallisilta”, selittää tohtori Doug Brough. ”Olemme kuitenkin havainneet, että tätä voidaan käyttää immuunivasteen stimuloimiseen vieraille materiaaleille, niin että adenoviruksia voitaisiin käyttää rokotteiden toimittamiseen.”
Tosiasiassa GenVec on tutkinut adenovirusta perusteellisesti ja tuottanut useita erilaisia ”makuja” adenoviruksista. Tutkiessaan adenoviruksia muissa lajeissa, kuten gorilla- ja apinalajeissa, tutkijat voivat käyttää vektoreita, jotka on suunniteltu välttämään ennalta olemassa oleva immuniteetti, joka ihmispopulaatiolla yleensä on adenoviruksia vastaan.
”GenVecin tarjoamaa laajaa vektoreiden kirjastoa kutsutaan Adenoverse™:ksi”, tohtori Brough ilmoittaa. ”Olemme poistaneet suuria osia adenoviruksesta rajoittaaksemme synnynnäistä toksisuutta, joka liittyy hoitoon adenoviruksella. Sen lisäksi, että estämme haitallisen immuunivasteen vektorille, tämä mahdollistaa sen, että virukseen mahtuu jopa 12 kb.”
Hyödyntämällä erilaisia lähestymistapoja GenVec on työskennellyt useiden yritysten kanssa erilaisten sovellusten, nukleiinihappohoitojen ja geeninmuokkaustekniikoiden parissa. Muokatut adenovirukset voivat toimittaa sinkkisormi-lähestymistapoja sekä in vitro että in vivo.
Esimerkki yhdestä tällaisesta yhteistyöstä löytyy Novartisin kliinisestä tutkimuksesta, jolla pyritään uudistamaan sisäkorvan aistinsoluja. ”Infektoimalla sisäkorvan soluja geenillä, joka koodaa keskeistä säätelyproteiinia, voidaan luoda uusia mekanosensorisia soluja korvaamaan vamman tai perinnöllisten geneettisten olosuhteiden vuoksi menetettyjä soluja”, selittää tohtori Brough.
Muita yhteishankkeita löytyy kumppanuuksien kanssa kokonaisuuksista syövän hoitamiseksi ja rokotteiden kehittämiseksi. ”Kun tulee aika kaupallistaa teknologia, GenVec käyttää solulinjaa, jonka FDA on aiemmin hyväksynyt näihin sovelluksiin”, selventää tohtori Brough.
”Toinen ilmeinen etu adenovirusten käyttämisessä on se, että niillä voidaan helposti transfektoida kokonaisia eläimiä. Esimerkiksi suu- ja sorkkataudiksi kutsuttua tuotantoeläinten tuhoisaa tautia levittävät erilaiset virotyypit. Järjestelmämme avulla voitaisiin vaihtaa nopeasti mitä tahansa kantaa, joka aiheuttaa taudinpurkauksen, ja tarjota nopeasti räätälöity rokote”, tohtori Brough kuvailee.
Nukleofektio
Lonza tarjoaa kehittynyttä elektroporaation muotoa nimeltä Nucleofection™, jossa käytetään solutyyppikohtaisia transfektioliuoksia yhdistettynä vivahteikkaampaan pulssiannostelujärjestelmään, joka mahdollistaa monien erilaisten solutyyppien, erityisesti normaalien primaaristen ihmissolujen, transfektion.
”Tavallisten elektroporaation puskuriliuosten sijaan käytämme solutyyppikohtaisia transfektioliuoksia”, sanoo tohtorikoulutettava Gregory Alberts, Lonzan maailmanlaajuinen asiantuntija. ”Näin pystymme vakauttamaan pulssitoimituksen aikana syntyvät huokoset”. Oletamme, että tavanomaisen elektroporaation aikana solukalvoon muodostuvat huokoset sulkeutuvat nopeasti. Teknologiamme stabiloi elektroporaatiossa muodostuvat huokoset ja sallii materiaalin diffundoitua soluun ja erityisesti solun ytimeen.”
Nukleofektiomenetelmässä hyödynnetään monia erilaisia substraatteja: DNA, mRNA, siRNA, peptidit, proteiinit ja pienet molekyylit. SiRNA:iden ja mRNA:iden transfektiotehokkuus on erittäin hyvä, yli 90 %. Pienet peptidit transfektoituvat yleensä noin 80 prosentin tehokkuudella, ja plasmidi-DNA:n tehokkuus on 50-90 prosenttia solutyypistä riippuen. Jopa suuret substraatit, suuremmat proteiinit, kuten vasta-aineet tai bakteerien keinotekoiset kromosomit (BAC), pääsevät kohdesoluihin kohtuullisen tehokkaalla transfektiotehokkuudella.
”Nukleofektio on yllättävän joustava”, Alberts toteaa. ”Sitä on käytetty kaikenlaisten primaaristen ihmissolujen transfektointiin. Sitä on käytetty iPSC:n (indusoitujen pluripotenttien kantasolujen) tuottamiseen, CRISPR:n ja muiden genominmuokkaussubstraattien transfektioon sekä eksoottisempien kohteiden, kuten malariaa aiheuttavien Plasmodium-perheen loisten, transfektioon. Myös muita samankaltaisia organismeja voidaan transfektoida Nucleofectionin avulla trooppisten sairauksien tutkimuksen mahdollistamiseksi.”
Nucleofection-alusta on skaalautuva. Esimerkiksi korkean läpimenon Nucleofection-järjestelmä pystyy käsittelemään 96-kuoppaisia ja 384-kuoppaisia formaatteja. Usein tätä järjestelmää käytetään ydinseulontalaitoksessa. Tutkimuspenkissä työskentelevät tutkijat voivat käyttää alhaisemman läpivirtauksen 4D-Nukleofektoria testiolosuhteiden optimointiin. Koska työpöydän 4D Nucleofector käyttää samoja transfektio-olosuhteita, toimii samoilla solumäärillä ja tuottaa saman suorituskyvyn kuin suuremman läpimenon laitteet, kun on aika siirtyä suurempaan mittakaavaan, määritystä ei tarvitse optimoida uudelleen.
”Järjestelmän jatkuvuus mahdollistaa omenoiden vertaamisen omenoihin, kun projektia skaalataan ylös- tai alaspäin”, havainnollistaa tohtori Alberts.
”Olemme parhaillaan beta-testaamassa uutta suuren volyymin transfektiolaitetta, jolla voidaan transfektoida 200 miljoonasta 1 miljardiin solua formaatissa, joka vaihtelee yhdestä 20 millilitraan. Alustavat tulokset osoittavat, että laite transfektoi primaarisia ihmissoluja tai solulinjoja samalla tasolla kuin muut Lonza Nucleofector -laitteet”, tohtori Alberts jatkaa. ”Tämä tuote tullaan julkaisemaan vain tutkimustarkoituksiin, vaikka koska Nucleofection pystyy transfektoimaan primaarisia ihmissoluja niin hyvin, on epäilemättä kiinnostusta käyttää tätä laitetta kliinisesti suuntautuneemmissa sovelluksissa.”
Dr. Alberts näkee, että Nucleofectionilla voisi olla merkitystä innovatiivisissa ja yksilöllisissä syöpähoidoissa, kuten CAR-T-hoidossa (kimeerinen antigeeni-T-soluhoito), sekä muissa solupohjaisissa hoitomuodoissa, jotka edellyttävät primaaristen ihmissolujen transfektiota tai genomimuuntelua.
”Nucleofectionin kyky transfektoida primaarisia ihmisen T-soluja helposti ja tehokkaasti herättää huomion tautien hoidossa käytettävissä geeniterapiamenetelmissä. Lonzan lähestymistapa mahdollisiin geeni-
terapiasovelluksiin on myös hyvin pieni. Tämä on ratkaisevan tärkeää, koska muista transfektiotekniikoista ’jäljelle jääneet’ koneistot voivat johtaa tahattomiin biologisiin seurauksiin”, päättää tohtori Alberts.
Lonzan tutkijat ovat arvioineet yhtiön Nucleofection-teknologian kykyä transfektoida dissosioituneita aikuisten rottien aortan sileitä lihassoluja (AoSMC). Kylmäkonservoidut rottien AoSMC-solut sulatettiin ja niitä kasvatettiin seitsemän päivän ajan 24-kuoppaisissa viljelylevyissä, ja solut transfektoitiin adheesiossa AD1 4D-Nucleofector Y -liuoksen avulla. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut kiinnitettiin ja analysoitiin. Aktiini näkyy punaisena, GFP vihreänä.
Formulaatiot
Mirus Bio kehittää ja valmistaa uudenlaisia transfektiformulaatioita, jotka mahdollistavat monenlaisten erityyppisten nukleiinihappomolekyylien korkean tehokkuuden ja alhaisen myrkyllisyyden. Monet valmisteet eivät sisällä eläinperäisiä komponentteja. ”Eläimettömyys” on tärkeä ominaisuus prekliinisissä ja kliinisissä sovelluksissa.
CRISPR-järjestelmä edellyttää ohjaavan RNA:n (gRNA) toimittamista ja Cas9-endonukleaasin ilmentymistä, joka voi olla proteiinin, mRNA:n tai DNA:n muodossa. Mirus Bio tarjoaa transfektioratkaisuja, jotka tukevat kaikkien erilaisten Cas9-koodaavien molekyylien tehokasta toimittamista. Kun käytetään kemiallisia transfektiomenetelmiä Cas9-proteiinin toimittamiseen, tutkijat voivat käyttää paljon pienempiä määriä proteiinia, jos se on esikompleksoitu gRNA:n kanssa.
”Joissakin vaikeasti transfektoitavissa olevissa solutyypeissä saadaan korkeampi pilkkomistehokkuus, kun Cas9-proteiini on kompleksoituna RNP-kompleksin (ribonukleoproteiini) sisällä”, toteaa Laura Juckem, tohtori Laura Juckem, Mirus Bio:n tutkimusryhmän päällikkö. ”Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System toimittaa RNP-kompleksit tehokkaasti ja mahdollistaa pienempien Cas9-proteiinipitoisuuksien käytön verrattuna elektroporaatioon.”
Yritysten haasteena on myös siirtyminen adheesioviljelmistä suspensioviljelmiin, jotta kliinisiin tutkimuksiin tarvittavan materiaalin suuri määrä mahtuu mukaan. Tämä koskee erityisesti rekombinanttien lentivirusten ja adeno-assosioituneiden virusten (AAV) tuotantoa. ”Teemme tiivistä yhteistyötä asiakkaidemme kanssa varmistaaksemme, että transfektiot onnistuvat ja että työnkulun muutokset tuottavat edelleen korkealaatuisia tuotteita”, selittää tohtori Juckem.
”Solupohjaista terapiaa varten kehitettiin CHO-gro® Expression System -järjestelmä, jolla saadaan korkea bioterapeuttisten proteiinien saanto suspensiossa olevissa CHO-soluissa. Tämä optimoitu järjestelmä edistää suuren tiheyden solukasvua ja antaa tutkijoille mahdollisuuden saada riittävästi proteiinia prekliinisten tutkimusten ja ensimmäisten karakterisointianalyysien suorittamiseen”, päättää tohtori Juckem.
Tämä kuva Mirus Bion esitelmästä, jossa kuvataan kantasolujen tehokasta transfektiota, osoittaa, että somaattisia soluja, kuten aikuisten fibroblastisoluja, voidaan transfektoida tai transduktioida useilla eri menetelmillä transkriptiotekijöiden yhdistelmällä. Kun solut on ohjelmoitu uudelleen pluripotenttiin tilaan, niitä voidaan ohjata eri kohtaloihin lisäämällä kasvutekijöitä ja/tai transfektoimalla solutyyppispesifisten promoottorien ohjaamia valintamarkkereita. Kuvassa korostetaan, että transfektioreagensseja voidaan lisätä kantasolutyönkulkuun useissa eri vaiheissa.
Kokonaan eläimiin perustuvia lähestymistapoja
Thermo Fisher Scientific seuraa asiakkaiden tarpeita tuottaa biologisesti merkityksellisempää tietoa käyttämällä primäärisoluja kuolemattomien solulinjojen sijaan. Primäärisoluja on perinteisesti vaikeampi transfektoida kemiallisilla menetelmillä. Primäärisoluviljelmistä saadut tiedot tuottavat kuitenkin yleensä vastauksia, jotka soveltuvat paremmin in vivo -kokoeläinmalleihin.
”Primäärisoluviljelmien transfektio DNA:lla on haastavaa.”
”Primäärisoluviljelmien transfektio DNA:lla on haastavaa. SiRNA:n (pieni inhiboiva ribonukleiinihappo), mRNA:n (sanansaattaja-RNA) ja proteiinien käyttäminen suoraan on helpommin omaksuttavissa primaarisoluissa, koska nämä yhdisteet on toimitettava vain sytoplasmaan eikä solun ytimeen”, toteaa tohtori Xavier de Mollerat du Jeu, Thermo Fisher Scientificin tutkimus- ja kehitystoiminnan johtaja.
”Toimitus tumaan tapahtuu solujen jakautuessa”, jatkaa tohtori de Mollerat.
”Koska primaarisolut eivät jakaannu yhtä helposti kuin solulinjat, voimme kiertää ongelman toimittamalla molekyylejä sytoplasmaan emmekä tumaan.”
Jatkaessamme biologisesti merkityksellisempien järjestelmien etsimistä kokonaisissa eläimissä ”olemme havainneet, että Invivofectamine® 3.0:n in vivo -käytöllä voidaan tehokkaasti vähentää proteiinien ilmentymistä 90 prosentilla maksasoluissa”, tohtori de Mollerat toteaa. ”Invivofectamiinin in vivo -käyttö antaa tutkijoille tehokkaamman mallin siitä, miltä hoidot näyttävät koko eläimessä.”
Transfektioteknologian toinen sovellus on rokotteiden kehittäminen. Rokotteiden kehittämisen aikataulua voidaan lyhentää valtavasti käyttämällä transfektoituja mRNA:ita ilmentämään antigeenejä, joita vastaan elimistö voi kehittää immuunivasteen. Kun otetaan huomioon maailmassa esiintyvien uusien virusten, kuten zika- ja chikungunya-virusten, määrä, kyky kehittää rokotteita nopeasti parantaa suuresti maailman terveyttä.
Syöpiin kohdistuvien immuunihoitojen jatkuvan kehityksen myötä T-soluja kohdennetaan usein spesifisillä reseptoreilla. ”Olemme tehneet yhteistyötä yritysten kanssa, jotka ovat kiinnostuneita kehittämään näitä terapioita”, selventää tohtori de Mollerat. ”Teemme tiivistä yhteistyötä yritysten kanssa ratkaistaksemme kysymykset siitä, miten näitä hoitoja voidaan valmistaa, tehdä näitä hoitoja suuressa mittakaavassa ja saattaa ne saataville maailmanlaajuisesti.”
Invivofectamine 3.0 on Thermo Fisher Scientificin tarjoama reagenssi in vivo RNAi:n toimittamiseen. Yhtiön mukaan yksittäinen injektio johtaa merkittävään knockdowniin ensimmäisenä päivänä ja jopa kolmen viikon ajan. Tämä havainto perustuu tutkimukseen, jossa reagenssi ruiskutettiin jyrsijän häntään eri annoksina (1, 0,5 ja 0,25 mg/kg). Seerumi kerättiin päivinä 2, 5, 9, 16, 23 ja 30, ja seerumista analysoitiin kromogeenisellä määrityksellä FVII-proteiinin tyrmäys. Yritys totesi, että suuremmat siRNA-määrät injektoiduissa komplekseissa johtivat pidempikestoiseen knockdowniin testatulla alueella.