1 Johdanto
tRNA:n taittuminen ja stabiilisuus on ratkaisevan tärkeää tehokkaalle translaatiolle, ja puutteet kummassakin ominaisuudessa voivat johtaa tRNA:n vähentyneisiin määriin, mikä johtaa kasvuvirheisiin hiivassa ja sairauksiin ihmisillä (Hopper, 2013; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). Hiivassa Saccharomyces cerevisiae on kaksi tärkeää solun laadunvalvontapolkua, joiden tiedetään hajottavan viallisia tRNA-lajeja. Ensimmäinen reitti on ydinvalvontareitti, joka vaikuttaa ytimessä olevaan pre-tRNA:han ydineksosomin ja TRAMP-kompleksin avulla (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006; Vanacova ym, 2005) hajottamalla pre-tRNAiMet, josta puuttuu m1A58-modifikaatio tai jonka 3′-traileri on väärin prosessoitu (Ozanick ym., 2009), ja osan villin tyypin (WT) pre-tRNA:sta (Gudipati ym., 2012). Toinen reitti on nopea tRNA:n hajoamisreitti (rapid tRNA decay, RTD), joka hajottaa spesifisiä kypsiä, hypomodifioituneita tai destabiloituneita tRNA-lajeja 5′-3′ eksonukleaasien Rat1 ja Xrn1 aktiivisuuden avulla (Alexandrov ym., 2006; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). RTD saadaan aikaan mutaatioissa, joista puuttuu jokin useista tRNA:n rungon modifikaatioista tai destabiloivien mutaatioiden kautta, ja kaikkien tunnistettujen RTD-substraattien osalta MET22:n deleetio palauttaa täysin tRNA:n määrän ja kasvun (Alexandrov et al., 2006; Chernyakov, Whipple, et al., 2008; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012; Guy et al., 2014; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). RTD:n tukahduttamisen met22Δ-kannoissa oletetaan johtuvan eksonukleaasien Rat1 ja Xrn1 estämisestä 3′-fosfoadenosiini-5′-fosfaatti-metaboliitilla, jonka pitoisuudet kasvavat Met22:n estyessä (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).
RTD:n tiedetään vaikuttavan useisiin spesifisiin tRNA-lajeihin, joita on tunnistettu ja tutkittu seitsemällä lähestymistavalla (kuva 1). Ensimmäisessä lähestymistavassa käytettiin mikrosiruja tRNA-tasojen vertailemiseksi koko genomin laajuisesti trm8Δ trm4Δ-lämpötilaherkissä modifikaatiomutanteissa (joista puuttuvat m7G46 ja m5C) ja sukulaiskannoissa semipermissive-olosuhteissa. Tällä tavoin tunnistimme RTD-substraatin tRNAVal(AAC), koska sen tRNA-tasot olivat pienentyneet trm8Δ trm4Δ-mutantissa suhteessa WT:hen tai vastaaviin yksittäisiin mutantteihin (Alexandrov ym., 2006).
Kuvio 1. RTD-substraatti. Eri lähestymistavat, joita käytettiin RTD-substraattien tunnistamiseen ja analysointiin.
Toisessa lähestymistavassa käytettiin northern bloteja sekä tRNA:n hajoamisnopeuden että RTD-substraattien spesifisyyden tutkimiseen lämpötilaherkissä modifikaatiomutanteissa. Tässä lähestymistavassa soluista eri ajankohtina lämpötilamuutoksen jälkeen eristetty RNA analysoitiin spesifisten tRNA:iden tasojen osalta. Tämän analyysin perusteella havaitsimme, että 50 % tRNAVal(AAC):sta hajosi trm8Δ trm4Δ-mutantissa 30 minuutin kuluessa siirrosta 28 °C:n lämpötilasta 37 °C:n lämpötilaan, kun taas vastaavalla tavalla hypomodifioiduissa tRNAiMet-, tRNAMet- ja tRNAPhe-mutaatioissa ei havaittu vähenemistä (Alexandrov ym., 2006; Chernyakov, Whipple ym., 2008). Lisäksi ladatun ja varauksettoman tRNA:n suhteelliset tasot voitiin mitata suorittamalla pohjoinen blotti happamissa olosuhteissa, mikä osoitti, että ladatun tRNAVal(AAC):n tasot vähenivät 50 % 25 minuutin lämpötilasiirtymän aikana trm8Δ trm4Δ-mutantissa ja että varauksettoman tRNAVal(AAC):n tasot näyttivät jäävän muuttumattomiksi (Alexandrov ym, 2006).
Kolmas lähestymistapa oli korkean kopion tRNA:n suppressio, jossa tiettyä tRNA:ta ilmentävä korkean kopion plasmidi tuotiin lämpötilaherkkään tRNA-muutosmutanttiin. Jos tRNA oli RTD-substraatti ja lämpötilaherkkyys johtui yksittäisen tRNA-lajin hajoamisesta, tRNA:n yliekspressio tukahduttaisi vian. Niinpä havaitsimme, että trm8Δ trm4Δ-mutantin lämpötilaherkkyys tukahdutettiin tRNAVal(AAC):aa ilmentävällä korkeakopioisella plasmidilla, mikä osoittaa, että lämpötilaherkkyys johtui ensisijaisesti tRNAVal(AAC):n menetyksestä ja että puuttuvat modifikaatiot olivat tärkeitä tRNA:n stabiilisuuden kannalta (Alexandrov ym., 2006). Vastaavasti myös useiden muiden tRNA-modifikaatiomutanttien RTD-substraatit on tunnistettu tätä lähestymistapaa käyttäen, mukaan lukien tRNASer(CGA) ja tRNASer(UGA) tan1Δ trm44Δ-mutanteissa (joista puuttuvat ac4C12 ja Um44) ja trm1Δ trm4Δ-mutanteissa (joista puuttuvat m2,2G26 ja m5C) (Chernyakov, Whipple, ym., 2008; Dewe ym., 2008), 2012; Kotelawala et al., 2008).
Neljänneksi käytimme geneettistä korvausmenetelmää tRNASer-perheen RTD-determinanttien tunnistamiseksi korvaamalla yksittäisen välttämättömän tRNASer(CGA)-geenin (SUP61) erilaisilla tRNASer(CGA)-variantteilla WT- ja met22Δ-kannassa, minkä jälkeen testasimme kasvua eri lämpötiloissa. Tätä lähestymistapaa käyttäen totesimme, että yhdistetyt akseptori- ja T-varren stabiilisuudet olivat vahvoja RTD-herkkyyden määrittäjiä tRNASer(CGA)-geeniperheessä (Whipple et al., 2011). Tätä päätelmää tuki myös viides lähestymistapa RTD:n mittaamiseen, jossa osoitimme in vitro, että tRNASer(CGA)-variantit, joista puuttuivat ac4C12 ja Um44 tai joilla oli akseptorivarren epävakauttavia mutaatioita, olivat alttiimpia Xrn1:n pilkkomiselle ja alttiimpia 5′-fosfaatin poistamiselle vasikan suoliston fosfataasilla (Whipple et al., 2011).
Tässä katsauksessa käsittelemme hiljattain kehittämiämme kuudetta ja seitsemättä lähestymistapaa RTD-substraattien tutkimiseen, jotka ovat osoittautuneet erittäin arvokkaiksi laajentaessamme ymmärrystämme RTD-reitistä. Kuudennessa lähestymistavassa käytetään fluoresoivaa reportteria tuhansien tRNA-varianttien kirjastojen kattavaan analysointiin WT- ja met22Δ-kannoissa. Tämän lähestymistavan avulla olemme tunnistaneet 643 todennäköistä RTD-substraattikandidaattia, joista monet ovat alueilla, joiden ei odoteta aiheuttavan RTD:tä aikaisemman työn perusteella (Guy ym., 2014). Esitämme tietoja, jotka osoittavat, että tätä lähestymistapaa voidaan käyttää tRNA:n toiminnan tutkimiseen eri olosuhteissa, ja keskustelemme lähestymistavan muista sovelluksista.
Seitsemännessä lähestymistavassa käytetään myrkkyprimerin pidennystä tRNA:n pitoisuuksien mittaamiseen WT- ja met22Δ-kannassa, ja se on arvokas siksi, että sen avulla voidaan mitata spesifisesti varianttista tRNA:ta jopa WT-tRNA:n läsnäollessa, jonka sekvenssi saattaa poiketa toisistaan vain yhden jäännöksen verran. Esitämme yksityiskohtaisen menetelmän tästä lähestymistavasta ja keskustelemme eräistä muista sen mahdollisista sovelluksista.