Tumor Xenograft

Characterization of Xenograft Banks

Työskentely PDX-kasvaimilla edellyttää, että perustetaan ja ylläpidetään kasvainpankki, joka istutetaan hiiriin ja siirretään sitten sarjaperäisesti sukupolvelta toiselle sukupolvelle, jollei tätä tapahtumaketjua keskeytetä näytteiden jäädyttämisellä. PDX-kasvainten uskotaan jäljittelevän alkuperäisen kasvaimen morfologisia ominaisuuksia tarkemmin kuin vakiintuneista solulinjoista tehdyt ksenotransplantaatit histologisen ja geneettisen profiloinnin osalta. Ne jäljittelevät ihmisen syöpien heterogeenisuutta, ja niillä on parempi arvo ennustettaessa hoitovastetta.8-16

Kuva 4.2. (A) Botryomykoosi (Staphylococcus-infektiosta johtuvat yhteenkasvaneet pyogranuloomat) ksenograftin istutuskohdassa. (A1) Pieni suurennos, jossa näkyy lukuisia nodulaarisia leesioita, jotka on upotettu kuituiseen sidekudokseen; (A2) suuri suurennos, jossa näkyy bakteeripesäkkeitä (nuolenkärki), Splendore-Hoeppli-reaktiolle tyypillinen eosinofiilinen reunus (nuoli) ja rappeutuneita neutrofiilejä (tähti; palkki = 50 μm). (B) Ksenograftin istutuskohtaan kehittyvä lymfooma, joka koostuu pienten pyöreiden solujen levyistä (sisäkuva: yksityiskohta suurennoksella; palkki = 20 μm). (C) Ksenograftin istutuskohtaan kehittyvä hiiren sarkooma, joka muodostuu fuusionmuotoisten solujen puroista (palkki = 50 μm). (D) Spontaani tyypin 2 adenooma hiiren keuhkoissa, jota makroskooppisesti epäillään PDX-kasvaimen metastaasiksi (palkki = 100 μm). (E) Whole-mount-tekniikka nodulaarisen leesion visualisoimiseksi rintarauhasen rasvapatjassa (palkki = 2 mm).

Tulehdukselliset leesiot on yleensä helppo tunnistaa histologisin menetelmin. Sitä vastoin kasvainten kohdalla voi olla vaikeampaa määrittää, onko kyseessä odotettu kasvain vai eri alkuperää oleva kasvain. Hiirten kasvaimet voivat nimittäin kehittyä ksenotransplantaatioiden kohdalle. Useimmat tällaiset kasvaimet ovat lymfoomia (kuva 4.2B)11 , mutta toisinaan havaitaan fusiformisia solusarkoomia (kuva 4.2C), ja harvinaisissa tapauksissa voidaan havaita myös muita hiirten kasvaimia, kuten rintarauhaskasvaimia naarashiirten ihonalaisessa kudoksessa. Spontaaneja kasvaimia tai kasvaimen kaltaisia leesioita voi kehittyä myös kaukaisiin elimiin, ja niitä saatetaan tulkita virheellisesti mahdollisiksi etäpesäkkeiksi (esim. keuhkojen adenoomat; kuva 4.2D). Kudoksen yksinkertainen morfologinen tutkimus osoittaa yleensä selvästi, onko kasvain samaa tyyppiä kuin alkuperäinen ihmisen kasvain. Tämä pätee erityisesti useimpiin karsinooman ksenotransplantaatteihin, joiden morfologia on hyvin erilainen kuin lymfoomien tai sarkoomien. Syöpäkasvaimet muodostuvat yleensä suurista soluista, jotka ovat selvästi järjestäytyneet rihmastoiksi, putkiksi tai lohkoiksi, joiden välissä on selvästi erottuva sidekudos. Lymfoomat (ihmisillä tai hiirillä) koostuvat pienistä pyöreistä soluista, joilla on niukasti stroomaa, ja sarkoomat koostuvat fuusionmuotoisista soluvirroista. Nämä eri kasvaintyypit on siis helppo erottaa toisistaan silmämääräisesti. Diagnoosi voi olla vaikeampi, jos alkuperäinen kasvain on ”sininen kasvain”, kasvain, joka koostuu pienistä soluista, joissa on hyvin vähän sytoplasmaa ja hyperkromaattinen tuma, ja joka näyttää mikroskoopissa pienellä suurennoksella hematoksyliini- ja eosiinivärjäyksen jälkeen syvästi basofiiliselta (sinertävältä). Blastiset kasvaimet, kuten retinoblastooma, ovat tyypillisesti sinisiä kasvaimia. Tällaisissa tapauksissa kasvaimen morfologiaa voi olla vaikea tulkita, varsinkin kun joidenkin kasvainten spesifisimmät ominaisuudet, kuten monien blastisten kasvainten ruusukkeet, puuttuvat yleensä tai ovat huonosti edustettuina ksenotrofissa. Anaplastisia kasvaimia, joissa kasvainsoluilla on vain vähän tai ei lainkaan morfologista samankaltaisuutta normaalien solujen kanssa, voi myös olla vaikea luonnehtia ilman aputekniikoita. Kuten todettiin, sarkooma on suhteellisen helppo erottaa lymfoomasta tai hyvin erilaistuneesta karsinoomasta, mutta sarkooman ksenotransplantaattien erottaminen tulehduksellisista leesioista tai hiirten sarkoomista voi olla haastavaa, koska nämä leesiot voivat olla morfologialtaan hyvin samankaltaisia6.

Käsiteltäessä vaikeita tapauksia tai yksinkertaisesti varmistaakseen ennen kokeen aloittamista, että kasvain todella on ihmisperäinen, voidaan ihmis- tai hiirisolujen tunnistamiseen käyttää useita erilaisia menetelmiä, jotka on suunniteltu paljastamaan lajispesifisiä proteiineja tai nukleotidisekvenssejä ja jotka perustuvat immunohistokemiaan tai in situ hybridisaatioon. Solulinjalle ominaisten proteiinien immunohistokemiallinen karakterisointi on hyödyllistä kasvaimen alkuperäkudoksen määrittämiseksi.

Erityistä huomiota on kiinnitettävä ihmisen lymfoomien mahdolliseen kehittymiseen muiden kuin lymfaattisten kasvainten siirtokohdassa, useimmiten alkuperäisen istutuksen aikana.11 Tällaisissa kasvaimissa on ihmissolujen spesifisiä merkkiaineita; tämä voi johtaa sekaannukseen todellisen ksenotransplantaation ja todellisen ksenotransplantaation välille, jollei vauriota tutkita morfologisesti. PDX-tutkimuksissa suurin osa havaituista ihmisen lymfoomista näyttää kehittyneen lymfosyyteistä, joita oli alkuperäiseen siirtoon käytetyssä kudosnäytteessä. Jos nämä solut infektoituvat Epstein-Barr-viruksella (EBV), B-lymfosyytit voivat muuntua kasvainsoluiksi.17,18 Immuunijärjestelmä eliminoi nämä solut tehokkaasti immunokompetenteilla ihmisillä, kun taas niiden siirtäminen immuunipuutteisiin hiiriin mahdollistaa pahanlaatuisten B-solujen kehittymisen ja niiden siirtymisen alkuperäisen ihmisen kasvaimen paikalle.11 Muutamia tapauksia EBV-negatiivisista perifeerisistä ihmisen T-solulymfoomista on myös kuvattu PDX-kontekstissa.19 Jos alkuperäinen ihmisen kasvain oli selvästi lymfoomasta poikkeava (esim. adenokarsinooma), ihmisen lymfooman kehittyminen on helppo hallita, sillä pelkkä morfologinen tutkimus riittää osoittamaan, että siirtokohdassa kasvava kasvain ei ole odotettua tyyppiä ja että se olisi siksi hylättävä. Jos alkuperäinen kasvain oli ”sininen kasvain”, sen osoittaminen, että verensiirtokohdasta löytyvä kasvain on ihmisperäinen, voi johtaa väärään tulkintaan, koska tarkempaa luonnehdintaa ei ole tehty, koska tämä kasvain voi itse asiassa olla ihmisen lymfooma, joka on syntynyt alkuperäisessä kasvaimessa olleiden EBV:llä infektoituneiden lymfosyyttien pahanlaatuisen muodonmuutoksen tuloksena, kuten aiemmin käsiteltiin.

Kun ksenotransplantaatti on vakiintunut (PDX-kasvaimia pidetään yleensä vakiintuneina kolmen tai viiden läpikäynnin jälkeen20), se olisi luonnehdittava sekä histologisen tyypin että erilaistumisen osalta. Kasvaimen histologinen tyyppi säilyy yleensä hyvin ksenotransplanteissa, joten esimerkiksi epidermoidikarsinoomilla ja tubulaarisilla adenokarsinoomilla on samat ominaisuudet, kun ne muodostavat PDX:n.21 Tämän fenotyyppisen stabiilisuuden ajatellaan olevan yhteydessä biokemialliseen stabiilisuuteen, koska merkittävät biokemialliset muutokset eivät todennäköisesti johtaisi morfologisten ominaisuuksien säilymiseen.6 Ensimmäinen kysymys, johon patologin on siis paneuduttava, on se, toistaako nykyinen kasvain emokudosten morfologiset ja biokemialliset ominaisuudet.17 Jos näin ei ole, se saattaa vastata hiiren kasvainta, tai kasvaimen erilaistumismallissa on saattanut tapahtua merkittävä muutos, mikä edellyttää lisätutkimuksia.8

Mutta joissakin ensimmäisen sukupolven siirteissä ja yhä useammin myöhempien läpikäyntien jälkeen jotkut kasvaimet saattavat olla vähemmän erilaistuneita, ja adenokarsinoomassa on vähemmän kanavia tai akinoita sekä enemmän mitoosia, ydinpleomorfiaa ja atypiaa.20

Kohtaiset morfologiset yksityiskohdat voivat muuttua sarjapassagointien aikana, jolloin esimerkiksi mukiinin eritys tai neuroendokriininen erilaistuminen lisääntyy, jotka molemmat ovat kasvaimen etenemisen kriteerejä joissakin karsinoomissa (esim. eturauhassyövät).22 Vastaavasti kasvaimen erilaistumismalli voi muuttua siirron olosuhteiden muuttuessa, kun isännän hormonaalinen tila muuttuu esimerkiksi kastraation tai hormonaalisen lisäaineen antamisen seurauksena.22

Patologien vaikeuksiin kuuluu sen määrittäminen, onko kasvaimen morfologia säilynyt verensiirron, sarjapassagointien tai kokeiden jälkeen. Samasta kasvaimesta peräisin olevat riippumattomat ksenotransplantaatit eivät nimittäin koskaan ole täysin identtisiä biologisen vaihtelun ja kasvainsisäisen heterogeenisuuden vuoksi. Jopa saman kasvaimen eri osissa ja saman osion eri alueilla voi olla morfologisia eroja. Solujen ja niiden tuman morfologiset ominaisuudet, niiden tilajärjestys, mitoosi-indeksi ja epätyypillisten mitoosien esiintyminen, apoptoottisten elinten määrä ja nekroosin esiintymistiheys, strooman runsaus ja verisuonisto eroavat toisistaan eri osissa ja eri kentissä. Patologin on sen vuoksi määritettävä, onko kasvaimen globaali kuvio säilynyt, ja mikä vielä tärkeämpää, vastaako vierasperäisen kasvaimen histologia alkuperäisen luovuttajakasvaimen histologiaa. Ihmisen kasvainten kansainvälisiä luokituksia olisi käytettävä ksenotransplantaattien tarkan patologisen luokittelun perustana, mutta jonkinasteista joustavuutta tarvitaan, koska ksenotransplantaatit eivät koskaan vastaa täydellisesti alkuperäisen ihmisen kasvaimen morfologiaa.

Kun ksenotransplantaatteja seurataan peräkkäisten läpikäyntien aikana tai kokeiden aikana, laadullisia muutoksia, kuten siirtymistä trabekulaarisesta kuvioinnista tubulaariseen, jos ne ovat toistettavissa, voidaan pitää merkittävinä, kun taas kvantitatiivisia muutoksia, kuten mitoosi-indeksin tai nekroosin määrän muutoksia, varsinkin jos ne ovat hienovaraisia, on tulkittava hyvin varovaisesti.

Muutama hankaluus kasvainstenonipankkikasvainten histologisissa analyyseissä johtuu morfologisen analyysin osittain subjektiivisesta luonteesta. Jos tarkkailijat tuntevat tietyn kasvaintyypin morfologian hyvin, heidän havaintokykynsä on hienosäädetty havaitsemaan pieniä yksityiskohtia, jotka saattavat ajan myötä tulla selvemmin esiin. On suositeltavaa valita vakiintuneesta PDX:stä näyte, jota käytetään referenssinä ja jota verrataan uusiin näytteisiin, jotta voidaan varmistaa, että dioja luetaan mahdollisimman objektiivisesti. Virtuaalisten preparaattien digitaalinen pankki voi helpottaa tätä tehtävää huomattavasti. Jos testilevyn ja vertailulevyn välillä ei ole havaittavissa selvää eroa, leesiota voidaan pitää ”samanlaisena”; tämä ei tarkoita sitä, että ne ovat identtisiä, vaan ainoastaan sitä, että niissä ei ole havaittavissa merkittäviä morfologisia muutoksia.

Ksenotransplantaatiokokeessa havaitun ensimmäisen näytteen osalta vertailulevyn tulisi olla näyte alkuperäisestä ihmiskasvaimesta tai sillä tulisi ainakin olla morfologinen kuvaus kuin kyseisellä kasvaimella potilaan patologisessa raportissa. Jos tällaista vertailukohtaa ei ole saatavilla, patologi voi yksinkertaisesti sanoa, että kasvain on ”morfologisesti yhteensopiva” tietyn luokan ihmisen kasvaimen ksenograftin kanssa.