1 Introduction
Le repliement et la stabilité de l’ARNt sont cruciaux pour une traduction efficace, et des défauts dans l’une ou l’autre propriété peuvent conduire à des quantités réduites d’ARNt, ce qui entraîne des défauts de croissance chez la levure et des maladies chez l’homme (Hopper, 2013 ; Yarham, Elson, Blakely, McFarland, & Taylor, 2010). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, il existe deux grandes voies de contrôle de la qualité cellulaire connues pour dégrader les espèces d’ARNt défectueuses. La première voie est la voie de surveillance nucléaire, qui agit sur les pré-ARNt dans le noyau par l’utilisation de l’exosome nucléaire et du complexe TRAMP (Kadaba, Wang, & Anderson, 2006 ; Vanacova et al…, 2005) en dégradant les pré-tRNAiMet dépourvus de la modification m1A58 ou avec un trailer 3′ mal traité (Ozanick et al., 2009) et une fraction des pré-tRNA de type sauvage (WT) (Gudipati et al., 2012). La deuxième voie est la voie de dégradation rapide des ARNt (RTD), qui dégrade des espèces spécifiques d’ARNt matures, hypomodifiés ou déstabilisés par l’activité des 5′-3′ exonucléases Rat1 et Xrn1 (Alexandrov et al., 2006 ; Chernyakov, Whipple, Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008). La RDT est déclenchée dans des mutants dépourvus de l’une des nombreuses modifications du corps de l’ARNt ou par des mutations déstabilisantes, et pour tous les substrats de la RDT identifiés, la délétion de MET22 rétablit complètement les niveaux d’ARNt et la croissance (Alexandrov et al, 2006 ; Chernyakov, Whipple, et al., 2008 ; Dewe, Whipple, Chernyakov, Jaramillo, & Phizicky, 2012 ; Guy et al., 2014 ; Kotelawala, Grayhack, & Phizicky, 2008 ; Whipple, Lane, Chernyakov, D’Silva, & Phizicky, 2011). La suppression de la RDT dans les souches met22Δ est présumée être due à l’inhibition des exonucléases Rat1 et Xrn1 par le métabolite 3′-phosphoadénosine-5′-phosphate, dont les niveaux augmentent lorsque Met22 est inhibé (Dichtl, Stevens, & Tollervey, 1997 ; Murguia, Belles, & Serrano, 1996).On sait que le
RTD agit sur plusieurs espèces spécifiques d’ARNt, qui ont été identifiées et étudiées par sept approches (Fig. 1). La première approche a consisté à utiliser des microréseaux pour comparer les niveaux d’ARNt à l’échelle du génome dans des mutants de modification sensibles à la température trm8Δ trm4Δ (dépourvus de m7G46 et m5C) et dans des souches apparentées dans des conditions semi-permissive. De cette façon, nous avons identifié le substrat RTD tRNAVal(AAC), puisqu’il présentait des niveaux d’ARNt réduits dans le mutant trm8Δ trm4Δ par rapport à WT ou aux mutants simples correspondants (Alexandrov et al., 2006).
Figure 1. Différentes approches utilisées pour identifier et analyser les substrats de la RDT.
Dans la deuxième approche, des Northern Blots ont été utilisés pour examiner à la fois le taux et la spécificité de la dégradation des ARNt pour les substrats de la RDT dans les mutants de modification sensibles à la température. Dans cette approche, l’ARN isolé des cellules à différents points de temps après le changement de température a été analysé pour les niveaux d’ARNt spécifiques. À partir de cette analyse, nous avons constaté que 50 % du tRNAVal(AAC) était dégradé dans un mutant trm8Δ trm4Δ dans les 30 minutes suivant un passage de 28 à 37 °C, alors que les tRNAiMet, tRNAMet et tRNAPhe hypomodifiés de façon similaire n’ont montré aucune diminution (Alexandrov et al., 2006 ; Chernyakov, Whipple, et al., 2008). En outre, les niveaux relatifs de l’ARNt chargé et non chargé ont pu être mesurés en effectuant le northern blot dans des conditions acides, ce qui a montré que les niveaux de l’ARNt chargé tRNAVal(AAC) ont été réduits de 50% dans les 25 min de changement de température dans un mutant trm8Δ trm4Δ et que les niveaux de l’ARNt non chargé tRNAVal(AAC) ne semblaient pas affectés (Alexandrov et al, 2006).
La troisième approche consistait en la suppression d’ARNt à haute copie, dans laquelle un plasmide à haute copie exprimant un ARNt particulier était introduit dans un mutant de modification d’ARNt sensible à la température. Si l’ARNt était un substrat de la RDT et que la sensibilité à la température était le résultat de la dégradation d’une seule espèce d’ARNt, alors la surexpression de l’ARNt supprimerait le défaut. Ainsi, nous avons trouvé que la sensibilité à la température d’un mutant trm8Δ trm4Δ était supprimée par un plasmide à haute copie exprimant tRNAVal(AAC), indiquant que la sensibilité à la température était principalement due à la perte de tRNAVal(AAC), et que les modifications manquantes étaient importantes pour la stabilité de l’ARNt (Alexandrov et al., 2006). De même, les substrats de la RDT de plusieurs autres mutants de modification de l’ARNt ont également été identifiés à l’aide de cette approche, y compris le tRNASer(CGA) et le tRNASer(UGA) dans les mutants tan1Δ trm44Δ (manquant ac4C12 et Um44) et dans les mutants trm1Δ trm4Δ (manquant m2,2G26 et m5C) (Chernyakov, Whipple, et al., 2008 ; Dewe et al, 2012 ; Kotelawala et al., 2008).
Quatrièmement, nous avons utilisé une approche de remplacement génétique pour identifier les déterminants de la RDT dans la famille tRNASer en substituant le seul gène essentiel tRNASer(CGA) (SUP61) par différents variants tRNASer(CGA) dans la souche WT et la souche met22Δ, puis en testant la croissance à différentes températures. En utilisant cette approche, nous avons déterminé que les stabilités combinées de l’accepteur et de la tige T étaient des déterminants forts de la susceptibilité à la RDT dans la famille de gènes tRNASer(CGA) (Whipple et al., 2011). Cette conclusion a été étayée par une cinquième approche de mesure de la RDT, dans laquelle nous avons montré in vitro que les variants tRNASer(CGA) dépourvus d’ac4C12 et d’Um44, ou présentant des mutations déstabilisantes dans la tige de l’accepteur, étaient plus enclins à la digestion par Xrn1 et plus sensibles à l’élimination du phosphate 5′ par la phosphatase intestinale de veau (Whipple et al, 2011).
Dans cette revue, nous discuterons de nos sixième et septième approches récemment développées pour l’étude des substrats de la RDT, qui se sont avérées extrêmement précieuses pour élargir notre compréhension de la voie de la RDT. La sixième approche utilise un rapporteur fluorescent pour analyser de manière exhaustive des bibliothèques de milliers de variantes d’ARNt dans des souches WT et met22Δ. Grâce à cette approche, nous avons identifié 643 candidats substrats probables de la RDT, dont beaucoup dans des régions qui ne devraient pas susciter la RDT sur la base de travaux antérieurs (Guy et al., 2014). Nous montrerons des données démontrant que cette approche peut être utilisée pour étudier la fonction de l’ARNt dans différentes conditions et discuterons d’autres applications de l’approche.
La septième approche emploie l’extension d’amorce de poison pour mesurer les niveaux d’ARNt dans une souche WT et met22Δ et est précieuse dans sa capacité à mesurer spécifiquement un ARNt variant même en présence de l’ARNt WT dont la séquence peut différer par un seul résidu. Nous fournissons une méthodologie détaillée de cette approche et discutons de certaines de ses autres applications possibles.