Transport de la cystine et cystinosine
La cystine s’accumule au sein des lysosomes des leucocytes14 et des fibroblastes cystinotiques44. La chloroquine et d’autres inhibiteurs de la dégradation des protéines lysosomales atténuent la ré-accumulation de cystine dans les cellules cystinotiques déplétées, ce qui indique que la dégradation des protéines intracellulaires est la source de l’excès de cystine45. La teneur en cystine des cellules normales et cystinotiques peut également être augmentée en les chargeant avec de l’ester diméthylique de cystine46 ou du disulfure mixte de cystéine et de glutathion44 ; cependant, la sortie de la cystine des lysosomes est nettement altérée dans les cellules cystinotiques chargées en cystine44,46. L’efflux de cystine des cellules dérivées de porteurs hétérozygotes du gène de la cystinose néphropathique n’est pas significativement altéré par rapport aux cellules de type sauvage44. Cependant, la mesure du contre-transport cystine-cystine dans les granules lysosomaux démontre clairement une absence chez les patients homozygotes, avec des valeurs pour les porteurs hétérozygotes qui sont environ la moitié de celles des cellules témoins normales47 ; le transport défectueux de la cystine lysosomale est donc le défaut causal de la cystinose.
Le diagnostic biochimique des patients48 et des porteurs hétérozygotes49 a été essentiel pour la cartographie fine du gène de la cystinose sur le chromosome 17p13. Une percée décisive a été la détection de délétions génomiques pour un marqueur microsatellite lié, suivie de l’identification du gène CTNS dans l’intervalle de délétion minimum.50 Le gène CTNS comprend 12 exons, codant pour une protéine de 367 acides aminés appelée cystinosine. La cystinosine se compose de sept domaines transmembranaires, d’une extrémité N de 128 acides aminés qui contient sept sites de glycosylation et d’une extrémité C cytosolique de 10 acides aminés. Tous les patients présentant les différents sous-types de cystinose semblent avoir une mutation dans le gène CTNS (c’est-à-dire qu’il n’y a aucune preuve jusqu’à présent d’une hétérogénéité génétique). La mutation la plus courante est une délétion de 57 kb qui déplace la région 5′ en amont de l’exon 1051,52 ; plus de 70 % des patients atteints de cystinose néphropathique d’origine nord-européenne sont homozygotes pour cette mutation52.-54 Bendavid et ses collègues ont mis au point des sondes d’hybridation in situ par fluorescence pour cette grande délétion, la première de ce type pour un trouble de stockage lysosomal.55 Des mutations distinctes à effet fondateur putatif ont été identifiées au Canada français56 (W138X, d’origine irlandaise) et dans la province de Bretagne en France57 (une mutation du site d’épissage à la fin de l’exon 8). Une mutation faux-sens récurrente (G339R) a été identifiée dans deux populations ethniques particulières : deux familles non apparentées d’origine amish-mennonite et cinq familles non apparentées d’origine juive-marocaine.58-61 Cinquante autres mutations du CTNS ont également été identifiées, dont au moins trois patients présentant des mutations dans la région promotrice du gène.62 Les patients atteints de cystinose juvénile ou oculaire sont homozygotes pour une mutation » plus légère « , généralement une mutation ponctuelle sans perturbation du cadre de lecture ouvert ; alternativement, ces patients sont des hétérozygotes composés pour une mutation légère et une mutation plus sévère17,59.
La cystinosine est largement exprimée, avec une transcription particulièrement abondante dans le pancréas, les muscles et les reins.50 L’immunohistochimie avec des anticorps anti-cystinosine63 et la transfection de cellules avec de l’ADN complémentaire (ADNc) marqué d’un épitope64,65 révèlent que la protéine est exprimée dans les lysosomes. Comme prévu, l’expression de la cystinosine est particulièrement robuste dans le tubule proximal rénal.63 La localisation de la cystinosine à la membrane lysosomale dépend à la fois d’un motif de tri lysosomal GYDQL à base de tyrosine situé sur la queue C-terminale et d’un pentapeptide YFPQA dans la cinquième boucle inter-transmembranaire. Le motif YFPQA est quelque peu unique dans la mesure où il s’agit d’un exemple rare de signal de tri lysosomal situé en dehors de la queue cytoplasmique.64 Il semble présenter une certaine capacité à sauver le tri de la cystinosine par lui-même, étant donné que le mutant de cystinosine avec un motif GYDQL absent mais un motif YFPQA intact se localise encore partiellement aux lysosomes.65 Une minorité de mutations de la cystinose affecte le ciblage lysosomal de la cystinosine, en raison d’une perturbation primaire du motif GYDQL ou d’effets non encore caractérisés sur la structure secondaire66.
La caractérisation fonctionnelle de la cystinosine a exploité la redirection de la protéine vers la membrane plasmique dans un mutant, la cystinosine-.GYDQL, qui ne possède pas le motif GYDQL C-terminal.67 La cystinosine-.GYDQL fonctionne donc comme un transporteur de cystine piloté par H+ au niveau de la membrane plasmique des cellules transfectées. Elle est hautement spécifique de la L-cystine ; les autres acides aminés, en particulier le monosulfure de cystéine, ne sont pas des substrats. La cystinosine est saturable et suit une cinétique de Michaelis-Menton, avec un Km pour la cystine de ∼280 μM.67 Le transport vers l’intérieur est considérablement stimulé par un pH extracellulaire acide-externe (Fig. 14-6) ; l’effondrement de ce gradient H+ transmembranaire par l’ajout de nigéricine abolit le transport, ce qui est cohérent avec le cotransport H+-cystine par la cystinosine. Le transport lysosomal de la cystine dépend à son tour de la présence d’adénosine triphosphate (ATP), qui alimente la H+-ATPase lysosomale et entraîne l’efflux de cystine (Fig. 14-7).46,68,69
La construction cystinosine-.GYDQL a été utilisée pour la caractérisation fonctionnelle de mutations faux-sens de la cystinosine associées à des maladies. Dans la plupart des cas, le transport et les phénotypes cliniques sont corrélés, avec l’abolition du transport par les mutations associées à la cystinose néphropathique et une fonction résiduelle médiée par les constructions exprimant les mutations associées aux sous-types juvéniles et oculaires de la maladie.66 Cependant, certaines mutations associées à la cystinose juvénile abolissent le transport dans le contexte de la cystinosine-.GYDQL, ce qui suggère que ces mutations ont des effets moindres sur la cystinosine pleine longueur exprimée dans les membranes lysosomales ; une possibilité est que la cystinosine interagisse avec des protéines lysosomales qui stabilisent ces formes mutantes particulières.66 L’inverse se produit également, de sorte que certaines mutations néphropathiques de la cystinose ont un effet minime sur le transport médié par la cystinosine-.GYDQL.66
La délétion ciblée de la cystinosine chez les souris entraîne une accumulation de cystine dans plusieurs organes, y compris les reins.70 Des dépôts focaux de cristaux de cystine peuvent être détectés dans plusieurs tissus, y compris dans les cellules des tubules proximaux. Cependant, ces souris ne présentent pas de tubulopathie proximale, ce qui suggère que l’accumulation de cristaux de cystine n’est pas à elle seule à l’origine de la maladie.70 Cependant, les anomalies oculaires chez les souris déficientes en cystinosine sont très similaires à celles des patients atteints de cystinose. Ces animaux développent ainsi des dépôts cornéens de cristaux de cystine et des taches dépigmentées dans leur rétine, ce qui indique une rétinopathie70
.