Détection et identification en laboratoire des espèces d’Aspergillus par observation microscopique et culture : l’approche traditionnelle

Abstract

Les tests moléculaires et immunologiques promettent un diagnostic de laboratoire meilleur et plus rapide de l’aspergillose, mais la microscopie et la culture restent des outils essentiels et couramment utilisés. Des changements de procédure, ainsi qu’une formation adéquate des professionnels de laboratoire, peuvent améliorer la valeur de ces outils traditionnels. L’utilisation du Blankophor ou du Calcofluor pour les examens microscopiques, l’amélioration de la reconnaissance des caractéristiques morphologiques des champignons opportunistes dans les frottis colorés des échantillons, l’optimisation du taux de croissance et de la production de conidies par Aspergillus spp. en culture et la reconnaissance des variantes atypiques des aspergillus communs peuvent améliorer la contribution du laboratoire à un diagnostic rapide. Les enquêtes indiquent que le nombre de professionnels de laboratoire est en baisse alors que la demande de soins de santé est en hausse. Le recrutement, la rétention et la formation efficaces du personnel doivent être concomitants aux progrès technologiques.

Introduction

Les méthodes traditionnelles de diagnostic de l’aspergillose et d’autres mycoses sont complétées par des approches moléculaires et immunologiques. Bien que les avantages des tests basés sur les acides nucléiques soient évidents, leur normalisation et leur utilité clinique n’ont pas été pleinement réalisées . En outre, si le test EIA au galactomannane pour l’antigène d’Aspergillus est largement disponible aux États-Unis, l’utilisation standard des tests basés sur les acides nucléiques pour l’identification des isolats cliniques semble limitée. Les laboratoires de référence proposant l’identification moléculaire des aspergillus comprennent les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, Géorgie, le Centraalbureau voor Schimmelcultur (CBS), Utrecht, Pays-Bas, et les laboratoires américains répertoriés dans le répertoire de tests en ligne de l’Association for Molecular Pathology. Bien que les méthodes moléculaires continuent de s’améliorer et deviennent plus facilement disponibles, la microscopie et la culture restent les principaux outils de laboratoire pour détecter les aspergillus. L’enquête comparative 2003 de l’American Society for Microbiology (ASM) a montré que 89 % des laboratoires effectuant des tests mycologiques utilisent la culture, 16 % la sérologie et moins de 5 % les tests moléculaires. Seuls 3 % des laboratoires déclarants utilisent des tests moléculaires « maison » pour les agents pathogènes microbiens. Étant donné la dépendance continue à l’égard de la microscopie et de la culture, la valeur diagnostique de ces méthodes doit être améliorée par des changements de procédure et une formation adéquate du personnel de laboratoire.

Microscopie

Les méthodes microscopiques, telles que les montages humides, les colorations de Gram et l’histopathologie conventionnelle, fournissent des indices qui suggèrent la présence d’Aspergillus spp. dans les tissus. Le Blankophor ou Calcofluor mélangé à 10%-20% d’hydroxyde de potassium (KOH), colore les parois cellulaires des champignons et améliore la détection des champignons. Alors que le Calcofluor se cristallise dans un pH alcalin, le Blankophor ne le fait pas et il peut être conservé dans une solution de travail pendant un an. Les marqueurs phénotypiques détectés par les colorations histopathologiques, ainsi que par la coloration de Gram ou les montages humides, fournissent des informations précieuses pour les champignons cliniquement importants, surtout en l’absence de culture (Tableau 1). Cependant, la confirmation des résultats microscopiques par la culture est toujours souhaitable et, dans la plupart des cas impliquant des moisissures opportunistes, essentielle pour l’identification définitive de l’agent pathogène. Malgré la présence d’indices visuels, l’identification des aspergillus par microscopie seule peut être trompeuse. Schell rapporte un cas de sinusite à Aspergillus niger dans lequel les conidies d’A. niger ont été confondues avec les cellules de levure de Candida spp. et des coupes transversales des stipes d’A. niger ont été confondues avec les hyphes larges d’un zygomycète. La communication entre le pathologiste clinique et le mycologue de laboratoire, qui identifie systématiquement les champignons filamenteux à partir de la culture, peut améliorer la valeur diagnostique de l’histopathologie.

Reconnaissance des caractéristiques morphologiques

Les aspergilles étant omniprésents dans la nature, ils peuvent couramment contaminer les spécimens et les milieux de culture. Par conséquent, la détermination de la signification des Aspergillus spp. se développant en culture est souvent un défi lorsque l’examen microscopique du spécimen est négatif. Dans une étude sur les isolats d’Aspergillus provenant de transplantés du foie et du rein, Brown et al. ont constaté que la présence de plus de deux colonies dans une culture et d’une infection dans plus d’un site permettait de prédire une infection significative. Chez les patients granulocytopéniques atteints de leucémie aiguë, un seul isolement provenant d’un échantillon des voies respiratoires inférieures doit être considéré comme significatif. Des rapports non ambigus des observations de laboratoire au médecin peuvent réduire le dilemme diagnostique. Par exemple, la déclaration « Un total de trois colonies d’Aspergillus fumigatus isolées sur deux des trois plaques » fournit plus d’informations que « Rare A. fumigatus isolé ».

Optimiser les résultats de la culture

L’isolement en culture et l’identification phénotypique des isolats cliniques courants d’Aspergillus spp. sont généralement rapides et faciles. Cependant, la culture est souvent décrite comme lente, créant peut-être des idées fausses sur sa valeur pour la détection des aspergillus. A. fumigatus a une croissance rapide. Les colonies veloutées typiques, gris-bleu-vert et les têtes conidiennes unisériées se développent en 24-48 heures sur les milieux fongiques et la gélose au sang de mouton couramment utilisée pour les cultures bactériennes. D’autres aspergillus associés à l’aspergillose invasive, notamment A. flavus, A. niger, A. nidulans et A. terreus, ont des taux de croissance similaires à ceux d’A. fumigatus lorsque les colonies sont mesurées sur de la gélose à l’extrait de malt et de la gélose à la levure Czapek après une incubation de sept jours à 25°C et à 37°C . La résistance aux médicaments de certaines espèces d’Aspergillus étant une menace, une identification complète, non seulement d’A. fumigatus, mais aussi des espèces moins fréquemment isolées, est justifiée. Les scientifiques de laboratoire doivent également reconnaître les isolats atypiques d’Aspergillus spp. Des souches faiblement sporulantes (blanches) d’A. fumigatus présentant une sensibilité réduite à plusieurs antifongiques ont été signalées récemment. Ces souches blanches ont une séquence génétique différente de celle du type sauvage, A. fumigatus Fresenius, et ne développent les têtes conidiennes bleu-vert typiques que 10 à 12 jours après l’incubation. Un autre défi est la moisissure blanche, Neosartorya fisheri, qui produit initialement des têtes conidiennes éparses ressemblant à celles de A. fumigatus. Cependant, N. fisheri développe ensuite de nombreux clistothèces ronds à parois fines, ce qui facilite la différenciation avec A. fumigatus. Un microscope à dissection est pratique pour localiser rapidement les têtes conidiennes et les clistothèces. Il peut y avoir des isolats d’A. fumigatus stériles, blancs, à croissance rapide ou glabres, en monticules, à croissance lente, qui nécessitent des tests de thermotolérance et d’exoantigènes pour une identification définitive. Khan et al. ont rapporté un isolat atypique d’A. terreus isolé à partir de spécimens des voies respiratoires inférieures d’un patient atteint d’aspergillome. Les colonies initiales étaient orange et produisaient un pigment jaune diffusible et de petites cellules uniques qui ont été confondues avec les conidies de Scedosporium apiospermum. Des anticorps précipitants et des têtes conidiennes typiques d’A. terreus produites après 10 semaines d’incubation ont confirmé l’identification.

Les images et les informations disponibles dans les manuels et sur Internet offrent de belles opportunités pédagogiques pour apprendre à identifier Aspergillus spp. L’expérience pratique reste cependant l’outil d’enseignement le plus efficace. Le CDC, le National Laboratory Training Network (NLTN) et la SCS proposent des ateliers de laboratoire. Lorsqu’il n’est pas possible de se déplacer, les laboratoires sont encouragés à utiliser le tutoriel en ligne, Aspergillus Reference Cultures , pour leur formation interne. Les organismes de référence qui y sont répertoriés sont disponibles à l’achat auprès des principales collections de cultures.

Analyser chaque étape de la procédure de culture peut conduire à une meilleure récupération des aspergillus. La liquéfaction des spécimens avec de la Sputolysine ou d’autres agents mucolytiques a été suggérée pour la récupération des champignons piégés dans le mucus des expectorations et du matériel sinusien récupéré lors d’une chirurgie endoscopique . L’utilisation de gélose dextrose de pomme de terre, de gélose en flocons de pomme de terre, d’extrait de malt, de gélose aux moisissures inhibitrices ou de géloses de sporulation similaires comme milieu d’isolement primaire pour Aspergillus spp. peut accélérer le taux de croissance et la production de conidies. L’ajout d’agents antibactériens aux milieux d’isolement permet de réduire le délai d’identification en inhibant la prolifération bactérienne et en réduisant la nécessité d’une sous-culture. L’incubation initiale des milieux fongiques à 35-37°C au lieu, ou en plus, de 30°C peut accélérer la croissance de certains aspergillus. De même, l’inspection quotidienne des milieux de culture permet de les détecter le plus tôt possible. En incubant des plaques de culture dans un environnement microaérophile à 35 °C, Tarrand a constaté que des Aspergillus spp. sélectionnés et cliniquement importants se développaient dans 12 cultures de bouillon sur 12. Les cultures des mêmes organismes incubées à 25 °C sans CO2 n’ont donné aucun résultat positif. D’autres études seraient utiles pour clarifier les milieux et les conditions les plus efficaces pour la récupération et l’identification rapide des aspergillus cliniquement importants.

Avec un montage rapide au Scotch-tape ou au tease, les têtes conidiennes d’Aspergillus spp. peuvent généralement être identifiées. Cependant, une culture sur lame peut être nécessaire lorsque la sporulation est lente ou atypique. Le rythme rapide de la plupart des laboratoires hospitaliers impose la méthode la plus simple, mais pas nécessairement la plus raffinée, pour réaliser la culture sur lame. La méthode classique de culture sur lame de Riddell a été complétée par d’autres techniques moins laborieuses. Une méthode rapide consiste simplement à enfoncer une lamelle de 18 × 18 mm à un angle de 45 degrés dans un milieu de sporulation, comme la gélose aux flocons de pommes de terre. Lorsque la moisissure sporule, la lamelle est soigneusement retirée de la gélose et montée dans une goutte de bleu de lactophénol ou de lacto-fuchsine sur une lame de microscope. Une autre goutte est placée sur la petite lamelle couvre-objet avant de compléter le montage avec une lamelle couvre-objet de 22 × 22 mm.

Problèmes de main-d’œuvre

Le diagnostic rapide de l’aspergillose dépend non seulement d’une méthodologie améliorée mais aussi d’une main-d’œuvre adéquate et bien formée. Les enquêtes sur les pratiques de mycologie recommandent fortement de renforcer la formation . L’accent doit être mis sur l’identification précise, l’examen direct, l’utilisation appropriée des milieux, la pertinence clinique et la rentabilité. Cependant, un personnel insuffisant peut compromettre à la fois la formation et la mise en œuvre de procédures plus pertinentes sur le plan clinique. L’enquête comparative de l’ASM a révélé une pénurie persistante de personnel dans certains laboratoires de microbiologie aux États-Unis. Cette pénurie résulte en partie d’une réduction de 53 % à 56 % des programmes de formation CLS au cours des 12 dernières années. Trente-quatre pour cent des professionnels travaillant aujourd’hui dans les laboratoires de microbiologie ont plus de 50 ans. Des travailleurs plus jeunes seront-ils disponibles pour les remplacer lorsqu’ils prendront leur retraite ? Alors que près de 80 % des femmes dans la population active ont moins de 30 ans, seulement 10 % des travailleuses dans les laboratoires de microbiologie ont moins de 30 ans . Ces données suggèrent que les pénuries de main-d’œuvre vont se poursuivre et peut-être s’aggraver.

Conclusion

L’amélioration des procédures de diagnostic traditionnelles et non traditionnelles des mycoses exige des efforts simultanés pour assurer une main-d’œuvre adéquate et améliorer la mobilité professionnelle, la reconnaissance professionnelle, les possibilités de formation avancée, la rémunération et d’autres facteurs nécessaires pour stimuler l’intérêt pour les sciences de laboratoire.