Cheadle a eu droit à sa carte de la Screen Actors Guild (SAG) lorsqu’il est apparu en tant qu’employé d’un hamburger dans la comédie Moving Violations en 1985. En 1987, il reçoit un petit rôle dans l’épisode 19 de la saison 7 de Hill Street Blues, où il joue un adolescent ayant des difficultés d’apprentissage. Cela a été suivi d’une apparition dans Hamburger Hill la même année. Cheadle a obtenu le rôle de Jack dans l’épisode « Jung and the Restless » de Night Court du 1er avril 1988. Bien que son personnage ait 16 ans, Cheadle avait 23 ans à l’époque.
Cheadle a ensuite joué le rôle de Rocket dans le film Colors de 1988. En 1989, il apparaît dans une vidéo pour le tube n°2 d’Angela Winbush, « It’s the Real Thing », exécutant des mouvements de danse dans une combinaison orange, en travaillant dans une station de lavage de voitures. En 1990, il apparaît dans un épisode de The Fresh Prince of Bel-Air intitulé « Homeboy, Sweet Homeboy », jouant le rôle de Ice Tray, l’ami de Will Smith et le premier intérêt amoureux d’Hilary. En 1992, il a joué un rôle secondaire dans le spin-off The Golden Girls, The Golden Palace. Cheadle a ensuite joué le rôle du procureur John Littleton dans trois saisons de Picket Fences.
Cheadle a d’abord été largement remarqué pour son interprétation de Mouse Alexander dans le film Devil in a Blue Dress, pour lequel il a remporté le prix du meilleur acteur de soutien de la Los Angeles Film Critics Association et de la National Society of Film Critics et a été nommé pour des prix similaires de la Screen Actors Guild et des NAACP Image Awards. Peu après, il a interprété le rôle-titre du téléfilm Rebound, diffusé sur HBO en 1996 : The Legend of Earl « The Goat » Manigault. Il a également joué dans le film Volcano, réalisé par Mick Jackson, en 1997. Il a également joué dans Rush Hour 2, avec Jackie Chan et Chris Tucker.
Les crédits de télévision deheadle comprennent des performances nommées aux Emmy dans les films The Rat Pack, A Lesson Before Dying, Things Behind the Sun et dans une apparition en tant qu’invité dans ER. Cette dernière s’étendait sur quatre épisodes de la neuvième saison de la série, dans laquelle il incarnait Paul Nathan, un étudiant en médecine qui luttait contre la maladie de Parkinson. Il a fait des apparitions dans des films tels que Rosewood, The Family Man, Boogie Nights, Out of Sight, Traffic et Ocean’s Eleven. Ces trois derniers ont été réalisés par Steven Soderbergh. Il a fait une apparition dans le film Abby Singer. En 2005, Cheadle a été nommé à l’Oscar du meilleur acteur pour son interprétation de Paul Rusesabagina dans le film Hôtel Rwanda. Il a également joué et coproduit le film Crash, qui a remporté l’Oscar du meilleur film en 2006. Pour sa performance dans Crash, Cheadle a été nommé pour les BAFTA et Screen Actors Guild Awards du meilleur acteur secondaire. Il a joué le personnage principal du film Traitor.
En mars 2007, Cheadle a joué avec le comédien Adam Sandler dans Reign Over Me de Mike Binder, une comédie dramatique sur un homme qui s’est éloigné de la réalité après la mort de sa femme et de ses trois filles lors du 11 septembre 2001. Le film a été un échec au box-office, avec des recettes nationales de 22,2 millions de dollars. Cheadle a ensuite joué dans le film Hotel for Dogs de DreamWorks Pictures en 2009. Cheadle devait faire ses débuts de réalisateur avec l’adaptation de Tishomingo Blues d’Elmore Leonard, mais en juillet 2007, il a déclaré : » ‘Tishomingo’ est mort… «
Cheadle est apparu dans des publicités de la NFL faisant la promotion du Super Bowl de 2002 à 2005. Il apparaissait si régulièrement pour la NFL dans ses publicités pour le Super Bowl qu’en 2006, dans le but d’inciter les fans à soumettre leurs propres idées publicitaires, la NFL lui a demandé la permission de faire référence à ses précédentes publicités pour se présenter comme n’ayant pas de nouvelles idées : « il a rapidement approuvé l’idée et l’a trouvée drôle ». Abe Sutton (avec Etan Bednarsh), l’un des finalistes de ce concours de la NFL, a joué sur cette publicité en proposant une publicité où chaque joueur d’une équipe de football est Don Cheadle.
En 2009, Cheadle et le créateur des Boondocks, Aaron McGruder, ont travaillé sur une potentielle émission comique sur NBC. Le « projet tourne autour de frères mal assortis qui se réunissent pour ouvrir une société de sécurité privée. » Cheadle et McGruder devaient servir de producteurs exécutifs, tandis que McGruder devait écrire le scénario.
En 2009 également, Cheadle a joué dans The People Speak, un long métrage documentaire qui utilise des représentations dramatiques et musicales des lettres, journaux intimes et discours d’Américains de tous les jours, basé sur A People’s History of the United States de l’historien Howard Zinn.
En 2010, Cheadle a endossé le rôle de War Machine / James Rhodes dans Iron Man 2 (2010), en remplacement de Terrence Howard. Cheadle a repris ce rôle dans Iron Man 3 (2013), Avengers : Age of Ultron (2015), Captain America : Civil War (2016), Avengers : Infinity War (2018), et Avengers : Endgame (2019), Le Faucon et le Soldat de l’hiver (2021) et il reprendra le rôle dans la prochaine série Disney+ Armor Wars.
De 2012 à 2016, Cheadle a joué dans la série télévisée de Showtime House of Lies. En 2013, il a remporté le Golden Globe du meilleur acteur dans une série comique pour son rôle dans la série.
Cheadle a passé dix ans à écrire et produire le film Miles Ahead (2016) basé sur la vie du musicien de jazz Miles Davis. Cheadle a également réalisé et joué dans le film. Les lieux de tournage du film ont été trouvés à Cincinnati.
En 2018, Cheadle a fait une guest-star dans le final de la première saison de DuckTales, fournissant la nouvelle boîte vocale de Donald Duck. Il a ensuite fait une nouvelle guest-star en 2020 lors de la saison 3 après qu’un vœu fait par Donald à Gene le Génie ait modifié la réalité.