Elisabeth épouse Philippe II d’Espagne, fils de Charles Quint, empereur du Saint-Empire romain germanique, et d’Isabelle du Portugal, en 1559. Initialement mariée par procuration à Notre-Dame (le duc d’Albe remplaçant Philippe) avant de quitter la France, la véritable cérémonie a eu lieu à Guadalajara, en Espagne, à son arrivée. Le mariage est le résultat de la paix de Cateau Cambrésis (1559). Sa seconde épouse, Marie Ier d’Angleterre, était récemment décédée, faisant d’Élisabeth de Valois la troisième épouse de Philippe.
À son mariage, elle rencontra le peintre Sofonisba Anguissola, et Ana de Mendoza, qui vivra avec elle le reste de sa vie. Philippe II nomme Anguissola dame d’honneur et peintre de la cour de sa reine. Sous la tutelle d’Anguissola, Élisabeth améliore ses talents de peintre amateur. Anguissola a également influencé les œuvres artistiques de ses enfants, Isabella Clara Eugenia et Caterina Michaela, pendant son séjour à la cour.
Philippe était complètement enchanté par sa jeune mariée de 14 ans, et en 1564, il avait renoncé à ses infidélités. Malgré la différence d’âge importante, Élisabeth était également très satisfaite de son mari (dans des lettres à sa mère, elle se proclamait chanceuse d’avoir épousé un prince aussi charmant). Philippe aimait organiser des tournois chevaleresques pour divertir sa femme. Elisabeth jouait le rôle de dame de compagnie des trois jeunes princes de la cour d’Espagne : Carlos, prince des Asturies, Jean d’Autriche (fils illégitime de Charles Quint), et Alexandre Farnèse, duc de Parme (fils de la fille illégitime de Charles Quint, Marguerite).
Elisabeth avait initialement été fiancée au fils de Philippe, Carlos, prince des Asturies, mais des complications politiques inattendues ont nécessité à la place un mariage avec Philippe. Sa relation avec son beau-fils Carlos était chaleureuse et amicale. Malgré les rapports sur son comportement de plus en plus bizarre, Carlos est toujours gentil et doux avec Elisabeth. Lorsqu’il devint finalement nécessaire pour Philippe de l’enfermer (ce qui conduisit peu après à la mort du prince), Élisabeth pleura pendant des jours.
Philippe était très attaché à Élisabeth, restant près d’elle même lorsqu’elle était malade de la variole. La première grossesse d’Elisabeth, en 1560, se solde par un fils mort-né, suivi en 1564 par une fausse couche de jumelles. Elle donne ensuite naissance à l’infante Isabella Clara Eugenia d’Espagne le 12 août 1566, puis à la jeune sœur d’Isabella, Catherine Michelle d’Espagne, le 10 octobre 1567. Philippe et Élisabeth étaient très proches de leurs deux filles, leur achetant des confitures, des poupées, des jouets, etc. On dit que « tous deux se sont réjouis de la naissance d’Isabella comme si c’était celle d’un fils ». Elisabeth fit une autre fausse couche le 3 octobre 1568, et mourut le même jour, avec sa fille nouveau-née en bas âge.
Après la mort d’Elisabeth, Catherine de Médicis proposa sa fille cadette Margaret comme épouse pour Philippe. Philippe déclina l’offre.