Caractérisation des banques de xénogreffes
Travailler avec des tumeurs PDX nécessite l’établissement et le maintien d’une banque de tumeurs, qui sont implantées dans des souris et ensuite transférées en série de génération en génération, à moins que cette chaîne d’événements ne soit interrompue par la congélation des échantillons. On pense que les PDX reproduisent les caractéristiques morphologiques de la tumeur originale plus précisément que les xénogreffes de lignées cellulaires établies, en termes de profilage histologique et génétique. Ils reproduisent l’hétérogénéité des cancers humains et ont une meilleure valeur pour prédire la réponse au traitement.8-16
Toute lésion se développant au niveau du site d’implantation, soit après la première prise de greffe (P0 dans ce texte), soit après un passage entre souris (Pn) doit être soigneusement étudiée pour s’assurer qu’elle correspond à la tumeur attendue. Ceci est important car les lésions se développant à cet endroit peuvent au contraire correspondre à des lésions inflammatoires (par exemple, un abcès ou un granulome, dus à une infection locale ou à l’inoculation de matériel étranger ; Fig. 4.2A) ou à des tumeurs inattendues d’origine murine ou humaine.
Figure 4.2. (A) Botryomycose (pyogranulomes coalescents dus à une infection par Staphylococcus) au site d’implantation de la xénogreffe. (A1) Faible grossissement, montrant de nombreuses lésions nodulaires noyées dans du tissu conjonctif fibreux ; (A2) fort grossissement, montrant des colonies bactériennes (tête de flèche), un rebord éosinophile typique d’une réaction de Splendore-Hoeppli (flèche) et des neutrophiles dégénérés (étoile ; barre = 50 μm). (B) Lymphome se développant au site d’implantation de la xénogreffe, composé de feuillets de petites cellules rondes (encart : détail à fort grossissement ; barre = 20 μm). (C) Sarcome murin se développant sur le site d’implantation de la xénogreffe, composé de courants de cellules fusiformes (barre = 50 μm). (D) Adénome spontané de type 2 dans un poumon de souris, soupçonné macroscopiquement d’être une métastase d’une tumeur PDX (barre = 100 μm). (E) Technique de montage entier pour la visualisation d’une lésion nodulaire dans un coussinet adipeux mammaire (barre = 2 mm).
Les lésions inflammatoires sont généralement faciles à identifier par des méthodes histologiques. En revanche, pour les tumeurs, il peut être plus difficile de déterminer si la tumeur est celle attendue ou si elle a une autre origine. En effet, des tumeurs murines peuvent se développer au niveau des xénogreffes. La plupart de ces tumeurs sont des lymphomes (Fig. 4.2B)11, mais des sarcomes à cellules fusiformes (Fig. 4.2C) sont parfois observés, et d’autres tumeurs murines, comme des tumeurs de la glande mammaire dans le tissu sous-cutané de souris femelles, peuvent également être observées dans de rares cas. Des tumeurs ou des lésions tumorales spontanées peuvent également se développer dans des organes distants et être interprétées à tort comme de possibles métastases (par exemple, des adénomes pulmonaires ; Fig. 4.2D). Un simple examen morphologique du tissu indique généralement clairement si la tumeur est du même type que la tumeur humaine d’origine. Ceci est particulièrement vrai pour la plupart des xénogreffes de carcinome, dont la morphologie est très différente de celle des lymphomes ou des sarcomes. Les carcinomes sont généralement formés de grandes cellules, clairement disposées en cordons, tubules ou lobules avec un interstitium conjonctif proéminent. Les lymphomes (qu’ils soient humains ou murins) sont constitués de nappes de petites cellules rondes avec un stroma peu abondant, et les sarcomes sont constitués de courants de cellules fusiformes. Il est donc facile de distinguer ces différents types de tumeurs à l’œil nu. Le diagnostic peut être plus difficile si la tumeur d’origine est une « tumeur bleue », une tumeur constituée de petites cellules avec très peu de cytoplasme et un noyau hyperchromatique, apparaissant profondément basophile (de couleur bleue) au microscope à faible grossissement après coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). Les tumeurs blastiques, telles que le rétinoblastome, sont typiquement des tumeurs bleues. Dans ce cas, la morphologie de la tumeur peut être difficile à interpréter, d’autant plus que les caractéristiques les plus spécifiques de certaines tumeurs, telles que les rosettes de nombreuses tumeurs blastiques, sont généralement absentes ou mal représentées dans les xénogreffes. Les tumeurs anaplasiques, où les cellules tumorales ont peu ou pas de similarité morphologique avec les cellules normales, peuvent également être difficiles à caractériser sans techniques auxiliaires. Comme indiqué, alors qu’il est relativement facile de différencier un sarcome d’un lymphome ou d’un carcinome bien différencié, différencier les xénogreffes de sarcomes de lésions inflammatoires ou de sarcomes murins peut être un défi, car ces lésions peuvent avoir une morphologie très similaire6.
Lorsqu’on a affaire à des cas difficiles, ou simplement pour confirmer qu’une tumeur est réellement d’origine humaine avant de commencer une expérience, plusieurs méthodes différentes conçues pour révéler des protéines ou des séquences nucléotidiques spécifiques à une espèce, basées sur l’immunohistochimie ou l’hybridation in situ, peuvent être utilisées pour identifier des cellules humaines ou murines. La caractérisation immunohistochimique des protéines caractéristiques d’un lignage cellulaire est utile pour préciser le tissu d’origine de la tumeur.
Une attention particulière doit être portée au développement possible de lymphomes humains au site de prise de greffe de tumeurs non lymphoïdes, le plus souvent lors de l’implantation initiale.11 Ces tumeurs portent les marqueurs spécifiques des cellules humaines ; cela peut conduire à une confusion avec une véritable xénogreffe si un examen morphologique de la lésion n’est pas effectué. Dans les études PDX, la plupart des lymphomes humains observés semblent se développer à partir des lymphocytes présents dans l’échantillon de tissu utilisé pour la greffe initiale. Si ces cellules sont infectées par le virus d’Epstein-Barr (EBV), les lymphocytes B peuvent subir une transformation et devenir des cellules tumorales.17,18 Ces cellules sont efficacement éliminées par le système immunitaire chez l’homme immunocompétent, alors que leur prise de greffe chez la souris immunodéprimée permet aux cellules B malignes de se développer et de prendre la place de la tumeur humaine initiale.11 Quelques cas de lymphomes T humains périphériques EBV-négatifs ont également été décrits dans le contexte des PDX.19 Si la tumeur humaine initiale était clairement différente du lymphome (par exemple, un adénocarcinome), le développement d’un lymphome humain est facile à gérer, car un simple examen morphologique suffit à montrer que la tumeur qui se développe sur le site de prise de greffe n’est pas du type attendu et doit donc être écartée. Si la tumeur initiale était une » tumeur bleue « , alors la démonstration que la tumeur trouvée au niveau du site de greffe est d’origine humaine peut conduire à une interprétation erronée en l’absence de caractérisation plus poussée, car cette tumeur peut en réalité être un lymphome humain résultant de la transformation maligne des lymphocytes infectés par l’EBV présents dans la tumeur initiale, comme discuté précédemment.
Lorsqu’une xénogreffe est établie (on considère généralement que les tumeurs PDX sont stabilisées après trois à cinq passages20), elle doit être caractérisée, tant au niveau de son type histologique que de sa différenciation. Le type histologique de la tumeur est généralement bien préservé dans les xénogreffes, ainsi les carcinomes épidermoïdes et les adénocarcinomes tubuleux, par exemple, ont les mêmes caractéristiques lorsqu’ils forment des PDX.21 On pense que cette stabilité phénotypique est liée à la stabilité biochimique, car des changements biochimiques marqués auraient peu de chances d’entraîner la préservation des caractéristiques morphologiques.6 La première question à laquelle le pathologiste doit répondre est donc de savoir si la tumeur présente reproduit les caractéristiques morphologiques et biochimiques des tissus parents.17 Si ce n’est pas le cas, il se peut qu’elle corresponde à une tumeur murine, ou qu’il y ait eu un changement majeur dans le schéma de différenciation de la tumeur, ce qui nécessiterait des investigations supplémentaires.8
Cependant, dans certaines des greffes de première génération et de plus en plus après d’autres passages, certaines tumeurs peuvent avoir tendance à devenir moins différenciées, avec moins de canaux ou d’acini dans les adénocarcinomes, et des taux plus élevés de mitose, de pléomorphisme nucléaire et d’atypie20.
Des détails morphologiques spécifiques peuvent changer au cours des passages en série, avec l’acquisition d’une sécrétion de mucine ou d’une différenciation neuroendocrine, par exemple, qui sont toutes deux des critères de progression tumorale dans certains carcinomes (par exemple, les cancers de la prostate).22 De même, le modèle de différenciation tumorale peut être altéré par des modifications des conditions de greffe, avec des changements du statut hormonal de l’hôte en raison de la castration ou de la supplémentation hormonale, par exemple.22
Déterminer si la morphologie de la tumeur est conservée après une prise de greffe, des passages en série ou des expériences sont une des difficultés rencontrées par les pathologistes. En effet, les xénogreffes indépendantes issues d’une même tumeur ne sont jamais strictement identiques, en raison de la variabilité biologique et de l’hétérogénéité intratumorale. Même différentes sections de la même tumeur et différentes régions de la même section peuvent présenter des différences morphologiques. Les caractéristiques morphologiques des cellules et de leurs noyaux, leur disposition spatiale, l’index mitotique et la présence de mitoses atypiques, le nombre de corps apoptotiques et la fréquence des nécroses, l’abondance du stroma et la vascularisation diffèrent entre les coupes et entre les champs. Le pathologiste doit donc déterminer si le schéma global de la tumeur est préservé et, plus important encore, si l’histologie de la tumeur xénogreffée correspond à celle de la tumeur originale du donneur. Les classifications internationales des tumeurs humaines devraient être utilisées comme base d’une classification pathologique précise des xénogreffes, mais un certain degré de flexibilité est nécessaire, car les xénogreffes ne reproduisent jamais parfaitement la morphologie de la tumeur humaine originale.
Lorsque les xénogreffes sont suivies au cours de passages successifs ou pendant des expériences, les changements qualitatifs, tels que le passage d’un motif trabéculaire à un motif tubulaire, s’ils sont reproductibles, peuvent être considérés comme significatifs, alors que les changements quantitatifs, tels que les modifications de l’indice mitotique ou de la quantité de nécrose, en particulier s’ils sont subtils, doivent être interprétés avec une grande prudence.
Une autre difficulté dans les analyses histologiques des xénobanques de tumeurs résulte de la nature partiellement subjective de l’analyse morphologique. Si les observateurs connaissent bien la morphologie d’un certain type de tumeur, alors leur perception est finement ajustée pour détecter les petits détails qui peuvent devenir plus apparents avec le temps. Il est conseillé de sélectionner un échantillon de PDX stabilisé qui servira de référence pour la comparaison avec de nouveaux échantillons, afin de garantir une lecture aussi objective que possible des lames. Une banque numérique de lames virtuelles peut grandement faciliter cette tâche. Si aucune différence évidente entre la lame test et la référence ne peut être détectée, alors la lésion peut être considérée comme « similaire » ; cela ne signifie pas qu’elles sont identiques, mais seulement qu’aucun changement morphologique significatif ne peut être détecté.
Pour le premier échantillon observé dans une expérience de xénogreffe, la référence doit être un échantillon de la tumeur humaine originale, ou au moins avoir une description morphologique comme la tumeur concernée dans le rapport de pathologie du patient. Si une telle référence n’est pas disponible, le pathologiste peut simplement dire que la tumeur est « morphologiquement compatible » avec une xénogreffe d’une tumeur humaine d’une catégorie donnée.