1 juin 2016 (Vol. 36, n° 11)
DeeAnn Visk Ph.D. Fondatrice et rédactrice principale DeeAnn Visk Consulting
La thérapie génique doit percer les remparts cellulaires sans rejouer la chute de Jéricho en miniature
Les immunothérapies contre le cancer, les vaccins contre les nouveaux virus (ou les anciens virus dans de nouveaux endroits) et les tentatives de résolution des défauts pathogènes unicellulaires cherchent tous à intégrer la technologie de transfection. Cette technologie, qui englobe divers moyens d’introduire des acides nucléiques dans les cellules, est très prometteuse, mais elle pose également de sérieux défis.
Ces défis ont été les plus marquants dans les tentatives de déploiement de la thérapie génique, qui a eu du mal à résoudre le problème des cellules, des organes et des animaux entiers difficiles à transfecter.
Ces défis de transfection ont été relevés par plusieurs sociétés de biotechnologie. Par exemple, MaxCyte, Lonza et Mirus Bio proposent l’électroporation comme une méthode qui laisse peu de résidus. Il se trouve que l’électroporation n’est pas utilisable avec tous les animaux, ce qui nécessite d’autres méthodes. Une technique alternative est l’infection virale. Elle est employée par des sociétés telles que GenVec.
Un autre défi, particulièrement pertinent pour la transfection virale, est le potentiel de stimulation d’une réponse immunitaire. Ce potentiel négatif peut cependant être un véritable positif dans le bon contexte, qui se trouve être le développement de vaccins. L’exploitation des approches de transfection virale pour renforcer les mécanismes de vaccination est une spécialité de Thermo Fisher Scientific. La société propose également une transfection traditionnelle à base de produits chimiques qui fonctionne chez l’animal entier.
Ensemble, les sociétés mentionnées jusqu’à présent proposent des technologies qui couvrent tous les principaux modes de transfection à visée thérapeutique : transfection à base de produits chimiques, méthodes non chimiques (principalement l’électroporation) et transduction virale. Des approches hybrides, également, sont en cours de développement, comme cela apparaîtra clairement dans les sections suivantes.
Electroporation
La plateforme d’électroporation de MaxCyte est conforme aux BPF et évolutive de manière transparente de la recherche à l’échelle commerciale. « Notre système d’électroporation en flux permet de transfecter un million à plusieurs centaines de milliards de cellules en moins de 30 minutes dans un système fermé entièrement automatisé », explique Madhusudan V. Peshwa, Ph.D., CSO. « Notre système est à la fois conforme à la norme ISO 9000 et à la norme FDA, il peut donc facilement répondre aux besoins de fabrication de niveau thérapeutique.
« Nous collaborons régulièrement avec des sociétés pharmaceutiques et biotechnologiques pour développer des thérapies ex vivo à base de cellules immunitaires et souches. Parfois, l’objectif est de fabriquer rapidement des vaccins et des médicaments biologiques à haut rendement tels que des anticorps. D’autres fois, nous permettons à nos clients de produire à grande échelle des vecteurs viraux de haut niveau en utilisant des cellules en suspension ou adhérentes. Non seulement cela contribue au développement thérapeutique, mais cela peut également accélérer les applications de découverte de médicaments. »
Cette capacité à traiter des cellules en grand ou en petit nombre permet aux scientifiques de la paillasse de développer un protocole de traitement utilisant l’électroporation en flux pour de petits nombres de cellules. La mise à l’échelle de ce processus se fait alors sans problème, sans les casse-tête habituels du maintien de la qualité, puisque le processus de transfection reste le même.
« Cette réduction des risques est très attrayante pour nos partenaires. Assurer la cohérence entre la recherche, la clinique, l’échelle commerciale et d’une série à l’autre, d’un donneur à l’autre et d’un patient à l’autre est essentiel pour guider efficacement les thérapies dans le processus de développement », affirme le Dr Peshwa.
Bien que les approches chimiques et lipidiques fonctionnent bien dans la recherche avec des lignées cellulaires établies, la transfection de cellules primaires a souvent des conséquences imprévues. De plus, ces moyens chimiques traditionnels de transfection des cellules sont difficiles à mettre à l’échelle de la production industrielle.
L’électroporation, l’approche non virale employée par MaxCyte, permet à la biologie des cellules transfectées de rester dans un état plus naturel à n’importe quelle échelle. En empêchant les conséquences involontaires pendant le processus de transfection, la technologie de MaxCyte peut éviter de créer des barrages routiers tout en résolvant le besoin d’une efficacité de transfection élevée.
« Ces interventions thérapeutiques doivent être pratiquement garanties pour avoir un impact négatif involontaire minimal sur les cellules modifiées – toute la biologie doit être la même pendant chaque étape du processus », insiste le Dr Peshwa. « En outre, notre système d’électroporation en flux peut être utilisé de manière automatisée. Il est déjà utilisé de façon routinière au Japon pour des traitements thérapeutiques commerciaux et est à divers stades d’adoption dans le monde entier. »
Une autre considération est le lieu où la transfection a lieu. Les cellules prélevées sur un patient sont-elles transportées dans une autre ville pour être traitées ? Que se passe-t-il lorsqu’un colis est perdu, ou retardé, ou subit des fluctuations de température ? La plateforme proposée par MaxCyte offre la possibilité de développer de nouvelles thérapies par le biais d’un traitement sur place des cellules des patients, en contournant les problèmes majeurs de logistique et de COGS (coût des marchandises vendues) des autres méthodes.
L’ingénierie des cellules est essentielle au développement des thérapies cellulaires. Le système d’électroporation de MaxCyte peut éviter la modification involontaire du phénotype cellulaire tout en répondant aux besoins clés des défis de l’ingénierie cellulaire : efficacité, cohérence, portabilité et évolutivité, selon la société.
Transductions virales
Les vecteurs viraux sont particulièrement utiles pour la tranfection d’animaux entiers ou pour l’utilisation de tissus qui peuvent être difficiles à atteindre par des approches chimiques ou d’électroporation. GenVec se spécialise dans l’utilisation de vecteurs viraux, en particulier l’adénovirus, pour délivrer des gènes à des fins thérapeutiques.
« À première vue, les problèmes associés à la réponse immunitaire aux vecteurs viraux semblent être problématiques », explique Doug Brough, docteur en médecine. « Cependant, nous avons découvert que cela peut être utilisé pour stimuler une réponse immunitaire à des matériaux étrangers, de sorte que les adénovirus pourraient être employés pour délivrer des vaccins. »
En effet, GenVec a étudié en profondeur l’adénovirus et a généré plusieurs « saveurs » différentes d’adénovirus. Lorsqu’ils explorent les adénovirus chez d’autres espèces, comme les espèces de gorilles et de singes, les chercheurs peuvent utiliser des vecteurs conçus pour éviter l’immunité préexistante que la population humaine générale a contre les adénovirus.
« La grande bibliothèque de vecteurs proposée par GenVec s’appelle l’Adenoverse™ », informe le Dr Brough. « Nous avons supprimé de larges sections de l’adénovirus pour limiter la toxicité innée associée au traitement par adénovirus. En plus de prévenir une réponse immunitaire délétère au vecteur, cela nous permet d’insérer jusqu’à 12 kb dans le virus. »
En utilisant une variété d’approches, GenVec a travaillé avec un certain nombre de sociétés sur différentes applications, des thérapeutiques d’acide nucléique et des technologies d’édition de gènes. Les adénovirus modifiés peuvent délivrer des approches en doigt de zinc, à la fois in vitro et in vivo.
On trouve un exemple d’une telle collaboration avec l’essai clinique de Novartis pour régénérer les cellules sensorielles dans l’oreille interne. « En infectant les cellules de l’oreille interne avec un gène codant pour une protéine régulatrice clé, de nouvelles cellules mécanosensorielles peuvent être générées pour remplacer celles perdues en raison d’une blessure ou de conditions génétiques inhérentes », explique le Dr Brough.
On trouve d’autres projets communs avec des partenariats dans des entités pour traiter le cancer et développer des vaccins. « Lorsque le moment est venu de commercialiser une technologie, GenVec utilise une lignée cellulaire préalablement approuvée par la FDA pour ces applications », clarifie le Dr Brough.
« Un autre avantage évident de l’utilisation des adénovirus est qu’ils peuvent facilement transfecter des animaux entiers. Par exemple, une maladie dévastatrice chez les animaux de ferme, appelée fièvre aphteuse, est perpétuée par une variété de virotypes. Notre système pourrait permettre d’échanger rapidement la souche à l’origine d’une épidémie et de fournir rapidement un vaccin sur mesure », décrit le Dr Brough.
Nucléofection
Lonza propose une forme avancée d’électroporation appelée Nucleofection™, qui utilise des solutions de transfection spécifiques à un type de cellule couplées à un système de livraison par impulsions plus nuancé qui permet la transfection de nombreux types de cellules différentes, en particulier les cellules humaines primaires normales.
« Plutôt que d’utiliser des solutions tampons d’électroporation standard, nous utilisons des solutions de transfection spécifiques à un type de cellule », explique Gregory Alberts, Ph.D., expert mondial en la matière chez Lonza. « Cela nous permet de stabiliser les pores générés lors de la délivrance des impulsions. Nous supposons que les pores formés dans la membrane cellulaire pendant l’électroporation standard se referment rapidement. Notre technologie stabilise les pores formés par l’électroporation et permet au matériel de diffuser dans la cellule et, plus spécifiquement, dans le noyau de la cellule. »
L’approche de la nucléofection utilise de nombreux substrats différents : ADN, ARNm, ARNsi, peptides, protéines et petites molécules. Les efficacités de transfection des siRNA et des ARNm sont très bonnes, supérieures à 90 %. Les petits peptides ont généralement une efficacité de transfection d’environ 80 %, et les efficacités pour l’ADN plasmidique sont comprises entre 50 % et 90 %, selon le type de cellule. Même les grands substrats, les protéines plus grandes comme les anticorps ou les chromosomes artificiels bactériens (BAC), peuvent pénétrer dans les cellules cibles avec des efficacités de transfection raisonnablement efficaces.
« La nucléofection est étonnamment flexible », déclare le Dr Alberts. « Elle a été utilisée pour transfecter toutes sortes de cellules humaines primaires. Elle a été utilisée pour la génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), la transfection de CRISPR et d’autres substrats d’édition du génome, ainsi que pour la transfection de cibles plus exotiques comme la famille des parasites Plasmodium qui causent la malaria. D’autres organismes similaires peuvent également être transfectés avec Nucleofection pour permettre la recherche sur les maladies tropicales. »
La plateforme Nucleofection est évolutive. Par exemple, le système Nucleofection à haut débit peut gérer les formats 96 puits et 384 puits. Ce système sera souvent utilisé dans une installation de criblage de base. Les scientifiques peuvent utiliser le Nucleofector 4D à faible débit pour optimiser les conditions de test. Étant donné que le Nucleofector 4D de paillasse utilise les mêmes conditions de transfection, fonctionne avec les mêmes nombres de cellules et offre les mêmes performances que les appareils à débit plus élevé, lorsqu’il est temps de passer à une échelle supérieure, le dosage ne nécessite pas de réoptimisation.
« La continuité du système permet de comparer des pommes avec des pommes lorsque vous augmentez ou diminuez l’échelle du projet », illustre le Dr Alberts.
« Nous sommes en train de tester en version bêta un nouveau dispositif de transfection à grand volume qui sera capable de transfecter 200 millions à 1 milliard de cellules dans un format allant de 1 à 20 mL. Les résultats préliminaires montrent que le dispositif transfecte les cellules humaines primaires ou les lignées cellulaires aux mêmes niveaux que les autres dispositifs Nucleofector de Lonza », poursuit le Dr Alberts. « Ce produit sera mis en circulation à des fins de recherche uniquement, bien qu’en raison de la capacité de Nucleofection à transfecter si bien les cellules humaines primaires, il y aura sans aucun doute un intérêt pour l’utilisation de ce dispositif dans des applications plus orientées vers la clinique. »
Le Dr. Alberts envisage que Nucleofection pourrait jouer un rôle dans les thérapies innovantes et personnalisées contre le cancer, telles que la thérapie par cellules T à antigène chimérique (CAR-T), ainsi que d’autres thérapies cellulaires nécessitant la transfection ou la modification génomique de cellules humaines primaires.
« La capacité de Nucleofection à transfecter facilement et efficacement les cellules T humaines primaires attirera l’attention dans les approches de thérapie génique pour traiter les maladies. L’approche de Lonza pour les applications potentielles de thérapie génique
a également une très petite empreinte. C’est crucial car les » restes » de machinerie provenant d’autres techniques de transfection peuvent entraîner des conséquences biologiques inattendues « , conclut le Dr Alberts.
Les scientifiques de Lonza ont évalué la capacité de la technologie Nucleofection de la société à transfecter des cellules musculaires lisses aortiques de rat adultes dissociées (AoSMC). Des AoSMC de rat cryoconservées ont été décongelées et cultivées pendant sept jours dans des plaques de culture à 24 puits, et les cellules ont été transfectées en adhérence à l’aide de la solution AD1 4D-Nucleofector Y. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été fixées et analysées. L’actine est représentée en rouge ; la GFP, en vert.
Formulations
Mirus Bio développe et fabrique de nouvelles formulations de transfection, qui permettent une livraison à haute efficacité et à faible toxicité de nombreux types différents de molécules d’acide nucléique. Un grand nombre de ces formulations sont exemptes de composants d’origine animale. « Sans animaux » est une qualité importante pour les applications précliniques et cliniques.
Le système CRISPR nécessite la délivrance d’un ARN guide (ARNg) et l’expression de l’endonucléase Cas9, qui peut être sous forme de protéine, d’ARNm ou d’ADN. Mirus Bio propose des solutions de transfection pour permettre la délivrance efficace de toutes les différentes molécules codant pour Cas9. Lors de l’utilisation de méthodes de transfection chimique pour la délivrance de la protéine Cas9, les chercheurs peuvent utiliser des niveaux beaucoup plus faibles de protéine si elle est précomplexée avec le gRNA.
« Certains types de cellules difficiles à transfecter donnent des efficacités de clivage plus élevées avec la transfection de la protéine Cas9 complexée dans le complexe RNP (ribonucléoprotéine) », déclare Laura Juckem, Ph.D., chef du groupe R&D chez Mirus Bio. « Le système de délivrance dynamique TransIT-X2® de Mirus délivre efficacement les complexes RNP et permet d’utiliser de plus faibles concentrations de protéine Cas9 par rapport à l’électroporation. »
Un autre défi auquel sont confrontées les entreprises est le passage des cultures adhérentes aux cultures en suspension afin d’accueillir la grande quantité de matériel nécessaire aux essais cliniques. Cela est particulièrement vrai pour la production de lentivirus recombinants et de virus adéno-associés (AAV). « Nous travaillons en étroite collaboration avec nos clients pour nous assurer que leurs transfections sont réussies et que les modifications apportées à leur flux de travail permettent toujours d’obtenir des produits de haute qualité », explique le Dr Juckem.
« Pour la thérapie cellulaire, le système d’expression CHO-gro® a été développé pour donner des rendements élevés de protéines biothérapeutiques dans des cellules CHO en suspension. Ce système optimisé favorise la croissance cellulaire à haute densité et permet aux chercheurs d’obtenir suffisamment de protéines pour réaliser des études précliniques et des analyses de caractérisation initiales « , conclut le Dr Juckem.
Cette image, issue d’une présentation de Mirus Bio décrivant la transfection à haut rendement des cellules souches, indique que les cellules somatiques telles que les cellules fibroblastes adultes peuvent être transfectées ou transduites via plusieurs méthodes avec une combinaison de facteurs de transcription. Une fois que les cellules ont été reprogrammées à un état pluripotent, elles peuvent être guidées vers différents destins par l’ajout de facteurs de croissance et/ou la transfection de marqueurs de sélection pilotés par des promoteurs spécifiques au type de cellule. L’image souligne que les réactifs de transfection peuvent être ajoutés à un flux de travail de cellules souches à plusieurs points.
Approches entièrement animales
Thermo Fisher Scientific reste au fait des besoins des clients pour générer des données plus pertinentes sur le plan biologique en utilisant des cellules primaires, plutôt que des lignées cellulaires immortalisées. Les cellules primaires sont traditionnellement plus difficiles à transfecter avec des méthodes chimiques. Cependant, les données générées à partir de cultures de cellules primaires ont tendance à fournir des réponses qui se traduisent mieux dans les modèles in vivo d’animaux entiers.
Les modèles de culture cellulaire tridimensionnelle, qui donnent des résultats plus pertinents que les cultures cellulaires bidimensionnelles, sont plus difficiles à transfecter avec les méthodes traditionnelles.
« La transfection des cultures primaires avec de l’ADN est un défi. L’utilisation directe d’ARNsi (petit acide ribonucléique inhibiteur), d’ARNm (ARN messager) et de protéines est plus facilement acceptée par les cellules primaires, car ces composés ne doivent être délivrés qu’au cytoplasme et non au noyau de la cellule », déclare Xavier de Mollerat du Jeu, Ph.D., directeur de R&D chez Thermo Fisher Scientific.
« La livraison au noyau se produit lorsque les cellules se divisent », poursuit le Dr de Mollerat. « Comme les cellules primaires ne se divisent pas aussi facilement que les lignées cellulaires, nous pouvons contourner le problème en livrant les molécules au cytoplasme plutôt qu’au noyau. »
Poursuivant la quête de systèmes plus pertinents sur le plan biologique chez les animaux entiers, « nous avons découvert que l’utilisation in vivo d’Invivofectamine® 3.0 peut effectivement faire chuter l’expression d’une protéine de 90% dans les cellules du foie », articule le Dr de Mollerat. « Cette utilisation in vivo de l’Invivofectamine donne aux scientifiques un modèle plus efficace de ce à quoi ressemblent les traitements chez l’animal entier. »
Une autre application de la technologie de transfection est le développement de vaccins. Le délai de développement des vaccins peut être considérablement raccourci en utilisant des ARNm transfectés pour exprimer des antigènes contre lesquels l’organisme peut développer une réponse immunitaire. Compte tenu du nombre de nouveaux virus que l’on trouve dans le monde, comme le Zika et le chikungunya, avoir la capacité de développer rapidement des vaccins améliorera grandement la santé mondiale.
Avec le développement continu des thérapies immunitaires ciblant les cancers, les cellules T sont souvent ciblées avec des récepteurs spécifiques. « Nous avons travaillé avec des entreprises intéressées par le développement de ces thérapies », élucide le Dr de Mollerat. « Nous travaillons en étroite collaboration avec les entreprises pour répondre aux questions sur la façon de fabriquer ces traitements, de les fabriquer à grande échelle et de les rendre disponibles dans le monde entier. »
L’invivofectamine 3.0 est un réactif fourni par Thermo Fisher Scientific pour la délivrance in vivo d’ARNi. Selon la société, une seule injection entraîne un knockdown significatif au jour 1 et jusqu’à 3 semaines. Ce résultat est issu d’une étude dans laquelle le réactif a été injecté dans la queue d’un rongeur à différentes doses (1, 0,5 et 0,25 mg/kg). Le sérum a été prélevé aux jours 2, 5, 9, 16, 23 et 30, et le sérum a été analysé pour la neutralisation de la protéine FVII par un test chromogène. La société a noté que des quantités plus élevées de siRNA dans les complexes injectés ont entraîné un knockdown plus durable sur la gamme testée.