Proteines

Lysozyme a été la première enzyme dont la structure aux rayons X a été déterminée à haute résolution. Cela a été réalisé en 1965 par David Phillips, travaillant à la Royal Institution de Londres. Phillips a ensuite proposé un mécanisme d’action du lysozyme basé principalement sur des données structurelles. Le mécanisme de Phillips a depuis été confirmé par des preuves expérimentales, comme nous le verrons plus loin.

Le lysozyme est largement présent dans les cellules et les sécrétions (y compris les larmes et la salive) des vertébrés, et le blanc d’œuf de poule est particulièrement riche en cette enzyme. Le lysozyme catalyse l’hydrolyse des liaisons glycosidiques qui relient l’acide N-acétylmuramique (NAM) et la N-acétylglucosamine (NAG) dans les polysaccharides des parois cellulaires bactériennes. Ce faisant, il endommage l’intégrité de la paroi cellulaire et agit ainsi comme un agent bactériocide. La liaison NAM-NAG est représentée sur la figure 40, avec le site de clivage par le lysozyme indiqué.

Figure 40 Une partie du composant polysaccharide des parois cellulaires bactériennes, montrant l’alternance des résidus d’acide N-acétylmuramique (NAM) et de N-acétylglucosamine (NAG). Ce polysaccharide est un substrat pour le lysozyme, qui hydrolyse la liaison glycosidique à la position indiquée. (Pour plus de clarté, et pour permettre une représentation linéaire de la molécule, certaines des liaisons sont représentées en zigzag.)

Le lysozyme est une enzyme relativement petite. Le lysozyme du blanc d’œuf de poule est constitué d’un seul polypeptide de 129 acides aminés de longueur (figure 41) avec Mr 14 600. D’après les données de diffraction des rayons X, nous pouvons voir qu’il existe une fente distincte dans la structure du lysozyme (Figure 42). Le site actif est situé dans cette fente. Dans la séquence d’acides aminés de la figure 41 et dans le modèle de remplissage d’espace du lysozyme de la figure 42, les résidus qui bordent la poche de liaison du substrat dans la protéine repliée ont été mis en évidence.

Figure 41 La séquence d’acides aminés du lysozyme de blanc d’œuf de poule, avec les résidus qui bordent la poche de liaison du substrat mis en évidence en gris. L’Asp 52 et le Glu 35, résidus clés du site actif, sont surlignés en rouge et en jaune respectivement.

Figure 42 Un modèle de remplissage d’espace du lysozyme de blanc d’œuf de poule dans lequel les résidus clés ont été surlignés. L’Asp 52 est en rouge ; le Glu 35 est en jaune ; certains des résidus bordant la poche de liaison du substrat sont représentés en gris.

Le site actif du lysozyme est un long sillon qui peut accueillir six sucres de la chaîne polysaccharidique à la fois. En fixant le polysaccharide, l’enzyme hydrolyse l’une des liaisons glycosidiques. Si les six sucres de la portion de polysaccharide sont identifiés comme étant A-F, le site de clivage se trouve entre D et E, comme l’indique la figure 40. Les deux fragments de polysaccharide sont alors libérés. La figure 43 représente les étapes de cette réaction, qui sont également décrites en détail ci-dessous.

Figure 43 Le mécanisme catalytique du lysozyme. Notez que seuls les résidus clés impliqués dans la catalyse (Glu 35 et Asp 52) sont représentés. Les étapes sont décrites en détail dans le texte. (Basé sur Phillips, 1966)

1. Lors de la liaison à l’enzyme, le substrat adopte une conformation tendue. Le résidu D est déformé (non représenté sur le schéma) pour accueillir un groupe -CH2OH qui, autrement, entrerait en contact défavorable avec l’enzyme. De cette façon, l’enzyme force le substrat à adopter une conformation se rapprochant de celle de l’état de transition.

2. Le résidu 35 de l’enzyme est l’acide glutamique (Glu 35) avec un proton qu’il transfère facilement à l’atome O polaire de la liaison glycosidique. De cette façon, la liaison C-O du substrat est clivée (Figure 43a et b).

3. Le résidu D du polysaccharide a maintenant une charge positive nette ; cet intermédiaire réactionnel est connu sous le nom d’ion oxonium (Figure 43b). L’enzyme stabilise cet intermédiaire de deux manières. Premièrement, un résidu aspartate voisin (Asp 52), qui est sous la forme carboxylate chargée négativement, interagit avec la charge positive de l’ion oxonium. Deuxièmement, la distorsion du résidu D permet à la charge positive d’être partagée entre son atome C et O. (Notez que ce partage de la charge entre les atomes est appelé résonance de la même manière que le partage des électrons entre les atomes du groupe peptidique). Ainsi, l’ion oxonium intermédiaire est l’état de transition. Normalement, un tel intermédiaire devrait être très instable et réactif. L’Asp 52 aide à stabiliser l’ion oxonium, mais il ne réagit pas avec lui. Cela est dû au fait que, à une distance de 3 Å, les groupes réactifs sont trop éloignés.

4. L’enzyme libère maintenant le résidu E avec son polysaccharide attaché, donnant un intermédiaire glycosyl-enzyme. L’ion oxonium réagit avec une molécule d’eau de l’environnement du solvant, extrayant un groupe hydroxyle et reprotonant Glu 35 (Figure 43c et d).

5. L’enzyme libère alors le résidu D avec son polysaccharide attaché et la réaction est terminée.

Le mécanisme de Phillips pour la catalyse du lysozyme, tel que décrit ci-dessus, est soutenu par un certain nombre d’observations expérimentales. En particulier, l’importance de Glu 35 et Asp 52 dans le processus a été confirmée par des expériences de mutagénèse dirigée par site (SDM). La MDS est une technique très puissante pour examiner le rôle des résidus d’acides aminés individuels dans la fonction d’une protéine et sera discutée en détail dans la section 7.2. La MJF implique l’utilisation de la technologie de l’ADN recombinant pour remplacer sélectivement le résidu d’intérêt par un autre acide aminé aux propriétés radicalement différentes. La protéine qui en résulte peut alors être testée sur le plan fonctionnel, par exemple en ce qui concerne la fixation du substrat ou l’activité catalytique. Lorsque cette technique a été appliquée au lysozyme pour remplacer le résidu Glu 35 par un résidu glutamine (Gln), la protéine résultante pouvait encore lier le substrat (bien que moins fortement) mais elle n’avait aucune activité catalytique. Glu 35 est donc essentiel pour l’activité catalytique du lysozyme. Lorsque l’Asp 52 a été remplacé par un résidu d’asparagine (Asn), la protéine mutante avait moins de 5 % de l’activité catalytique du lysozyme normal (type sauvage), malgré le fait que la forme mutante avait une affinité deux fois plus élevée pour le substrat. Il s’ensuit que l’Asp 52 est essentiel à l’activité catalytique du lysozyme. Des expériences utilisant des agents chimiques qui modifient de manière covalente ces résidus, sans affecter de manière significative la structure aux rayons X, ont également prouvé qu’ils étaient essentiels à l’activité catalytique.