Relation entre la taille du réservoir du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) dans les cellules T CD4+ du sang périphérique et les ratios de cellules T CD4+ :CD8+ T Cell Ratios in Aviremic HIV-1-Infected Individuals Receiving Long-Term Highly Active Antiretroviral Therapy

Abstract

Il a été démontré que la réplication du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) persiste chez la plupart des personnes infectées recevant une thérapie antirétrovirale hautement active (HAART). Cependant, les études portant sur la relation entre les faibles niveaux de réplication virale en cours et les paramètres immunologiques, tels que le rapport entre les lymphocytes T CD4+ et CD8+, chez ces personnes ont fait défaut. Cette étude montre une corrélation inverse statistiquement significative entre la fréquence des cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1 et le rapport des cellules T CD4+:CD8+ chez les personnes infectées recevant une thérapie HAART et chez qui la virémie plasmatique a été supprimée en dessous du seuil de détection pendant des périodes prolongées. Aucune corrélation n’a été trouvée entre la fréquence des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) spécifiques du VIH-1 et les ratios de cellules T CD4+:CD8+ chez ces personnes. Ces données suggèrent que la réplication virale persistante, de faible niveau, en cours, bien qu’elle ne soit pas suffisante pour maintenir les réponses CTL spécifiques du VIH-1, peut expliquer, en partie, pourquoi la normalisation du ratio des cellules T CD4+ :CD8+ n’est pas atteinte chez certaines personnes infectées traitées avec succès par HAART.

L’utilisation d’une thérapie antirétrovirale hautement active (HAART) dans le traitement des personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH- 1) a considérablement changé le résultat clinique pour de nombreuses personnes infectées et a conduit à une baisse substantielle de l’incidence du SIDA et de la mortalité . Cependant, la présence d’un virus capable de se répliquer ,de l’ADN proviral du VIH-1 (y compris2 cercles répétitifs longs terminaux ), de l’ARN du VIH-1 épissé et non épissé dans les cellules T CD4+, et de réservoirs de virus non identifiés a été démontrée chez la plupart des personnes infectées chez qui la virémie plasmatique est tombée en dessous de la limite de détection, et ces sources de réplication continue sont apparues comme l’obstacle majeur pour empêcher l’éradication du VIH-1.

Après le début de la multithérapie, la virémie plasmatique diminue rapidement pour passer en dessous de la limite de détection chez une forte proportion d’individus infectés et est suivie d’une augmentation progressive du nombre de cellules T CD4+ et d’une diminution du nombre de cellules T CD8+. Cependant, la normalisation du rapport entre les lymphocytes T CD4+ et CD8+ n’est pas atteinte chez certaines personnes infectées qui ont par ailleurs répondu avec succès à la multithérapie. À cet égard, il a été suggéré que les niveaux chroniquement élevés de cellules T CD8+ ou les ratios anormaux de cellules T CD4+:CD8+ dans le sang périphérique sont dus à une réplication virale active chez les personnes infectées qui ne sont pas traitées ou qui reçoivent un traitement antiviral sous-optimal. En outre, il a été démontré que l’expression du marqueur d’activation CD38 sur les cellules T CD8+ est un marqueur pronostique de la progression de la maladie. Bien qu’il ait été suggéré que l’échec de la normalisation du ratio des cellules T CD4+:CD8+ chez certains patients recevant une HAART soit attribué à une suppression incomplète de la réplication virale , il n’existe pas de données rapportées abordant directement cette question, en particulier chez les patients qui ont reçu une HAART pendant des périodes prolongées et chez lesquels la virémie plasmatique a été bien supprimée.

Il a été établi que le réservoir de cellules T CD4+ infectées dans le sang périphérique, tel que déterminé par le nombre de cellules portant l’ADN proviral du VIH-1, est maintenu par la réplication virale en cours, même à des niveaux très faibles . Dans la présente étude, nous avons évalué la relation entre les rapports du nombre de cellules T CD4+:CD8+ et la fréquence des cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1 dans les cellules T CD4+ purifiées, ainsi que la fréquence des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques du VIH (CTL) chez les personnes infectées qui ont reçu une HAART pendant des périodes prolongées et chez qui la virémie plasmatique a été supprimée jusqu’à un niveau inférieur au niveau de détection, tel que déterminé par les tests standard.

Patients et méthodes

Isolation des cellules T CD4+. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été obtenues par centrifugation en gradient de densité ficoll-hypaque. Les cellules T CD4+ ont été isolées à partir des PBMC de personnes infectées par le VIH-1, à l’aide d’une technique de séparation cellulaire sur colonne (Stem-Cell Technologies), comme décrit ailleurs .

Quantitative real-time HIV-1 DNA PCR. Pour déterminer la fréquence des cellules T CD4+ porteuses du provirus du VIH-1 chez les individus infectés, une PCR en temps réel a été réalisée comme décrit ci-dessous. L’ADN génomique a été isolé à partir de 1 à 2 × 106 cellules T CD4+ purifiées, à l’aide du kit d’isolement d’ADN Puregene (Gentra), conformément aux spécifications du fabricant. L’ADN (1 µg) a ensuite été utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel dans un iCycler (Bio-Rad). La réaction d’amplification a été réalisée en triplicata en utilisant 0,5 µM d’amorces, 0,2 µM de sonde fluorescente, 0,8 µM de dNTPs, 5 µM de MgCl2 et 2,5 U de Platinum Taq Polymerase (Life Technologies) dans un volume total de 50 mL. Les amorces 5′- GGTCTCTCTGGTTAGACCAGAT-30 (amorce 5′) et 5′-CTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ (amorce 3′) ont été utilisées ainsi que la sonde fluorescente 5′-6FAM-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTTAMRA- 3′. Les conditions de PCR consistaient en une étape de dénaturation à 95°C pendant 3 min, suivie de 45 cycles de 15 s à 95°C et 1 min à 58°C. L’ADN ACH-2 dilué en série a également été soumis à la PCR ci-dessus pour obtenir des courbes standard.

Analyse par cytométrie en flux des cellules T CD8+ spécifiques du VIH-1. La fréquence des cellules T CD8+ spécifiques du VIH-1 a été déterminée par l’analyse des cellules positives à l’interféron (IFN)-γ intracellulaire après stimulation par des peptides spécifiques du VIH-1 (20 mer chevauchant 15 aa). Des pools de peptides chevauchants (1 µg chacun ; National Institutes of Health AIDS Reagent Program) couvrant l’ensemble des séquences gag, pol, env et nef du VIH-1 ont été initialement incubés avec 3 × 106 PBMC pendant 10 minutes dans un tube de 5 ml à fond rond (Becton Dickinson) dans 0,1 ml de milieu complet dans un incubateur à CO2 à 37°C. Ensuite, 0,4 ml de milieu complet ont été incubés dans un tube de 5 ml à fond rond (Becton Dickinson). Ensuite, 0,4 mL de milieu complet a été ajouté au tube et, après une incubation de 2 h, de la Brefeldine A (Sigma) a été ajoutée au milieu à une concentration finale de 10 mg/mL pour inhiber la sécrétion d’IFN-γ. Après 6 h d’incubation, les cellules ont été lavées deux fois, fixées avec une solution de fixation 1× (Becton Dickinson) pendant 10 min à température ambiante, puis lavées à nouveau. Les cellules ont été perméabilisées avec 1× solution de perméabilisation 2 (Becton Dickinson), puis incubées à température ambiante pendant 10 min. Après un nouveau lavage, les cellules ont été colorées avec les anticorps suivants : anti-CD8 conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine, anti-IFN-γ conjugué à la phycoérythrine, anti-CD69 conjugué à la péridinine et à la protéine chlorophyllienne, et anti-CD3 conjugué à l’allophycocyanine (Becton Dickinson). Avec une porte sur les lymphocytes CD3+CD8+, ~100 000 événements ont été collectés, à l’aide d’un FACSCalibur (Becton Dickinson), et la fréquence des cellules IFN-γ + CD69+ a été déterminée à l’aide du logiciel Cellquest (Becton Dickinson).

Analyse statistique. La corrélation de rang de Spearman a été utilisée pour mesurer la corrélation entre (1) la fréquence des cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1 et le nombre de cellules T CD4+ et CD8+ et le rapport des cellules T CD4+:CD8+ et (2) la fréquence des CTL spécifiques du VIH-1 et le nombre de cellules T CD4+ et CD8+, le rapport des cellules T CD4+:CD8+ et le nombre de cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1. Le test exact de Fisher a été utilisé pour déterminer l’association des ratios cellules T CD4+:CD8+ ⩾1,0 ou <1,0 avec les charges provirales dans le compartiment des cellules T CD4+. La méthode de Bonferroni pour l’ajustement des valeurs P en cas de tests multiples a été appliquée aux corrélations du nombre de cellules T CD4+ et CD8+ et du rapport cellules T CD4+:CD8+ avec la fréquence des cellules T CD4+ portant l’ADN proviral du VIH-1, et elle a été appliquée aux corrélations du nombre de cellules T CD4+ et CD8+, du rapport cellules T CD4+:CD8+ et des niveaux d’ADN proviral du VIH-1 dans le compartiment des cellules T CD4+ avec la fréquence des CTL spécifiques du VIH-1.

Résultats

Corrélation entre la taille du réservoir de cellules T CD4+ du VIH-1 et les paramètres immunologiques. Pour étudier la relation entre la taille du réservoir de cellules T CD4+ du sang périphérique pour le VIH-1 et les paramètres immunologiques périphériques anormaux chez les personnes infectées recevant une HAART réussie pendant des périodes prolongées, nous avons cherché à établir des corrélations entre la fréquence des cellules T CD4+ portant l’ADN proviral du VIH-1 et le nombre de cellules T CD4+ et CD8+ et le ratio de cellules T CD4+ :CD8+. Une corrélation inverse statistiquement significative a été observée entre la fréquence des cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1 et le nombre de cellules T CD4+ dans le sang périphérique des personnes infectées que nous avons étudiées (P = 0,02 ; figure 1A). En revanche, aucune corrélation n’a été trouvée entre la charge en ADN proviral du VIH-1 dans les cellules T CD4+ et le nombre de cellules T CD8+ (P = 0,34 ; figure 1B). Lorsque ces 2 paramètres immunologiques ont été combinés et exprimés sous la forme d’un rapport cellules T CD4+:CD8+, une forte corrélation inverse a été observée entre ces valeurs et la fréquence des cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1 (P .01 ; figure 1C). En outre, 14 (74 %) des 19 patients présentant un rapport cellules T CD4+:CD8+ ,1,0 avaient une charge provirale d’ADN du VIH-1 <1000 copies/µg d’ADN génomique provenant de cellules T CD4+. Au contraire, 10 (77 %) des 13 patients présentant un rapport cellules T CD4+:CD8+ >1,0 avaient des charges provirales d’ADN VIH de ,1000 copies/mg d’ADN génomique dérivé des cellules T CD4+ (P = 0,01 ; figure 1C).

Corrélation entre la fréquence des CTL spécifiques du VIH-1 et les paramètres immunologiques et virologiques. Il a été démontré que la fréquence des CTL spécifiques du VIH-1 diminue progressivement après le début de la HAART chez les personnes infectées par le VIH-1 en raison de la diminution de la disponibilité des antigènes du VIH-1 . Nous avons étudié la relation entre la fréquence des CTL spécifiques du VIH-1 et les ratios de cellules T CD4+:CD8+ chez des individus infectés qui avaient répondu avec succès à une HAART pendant des périodes prolongées. Aucune corrélation statistiquement significative n’a été trouvée entre la fréquence des CTL qui ont répondu aux peptides spécifiques du VIH dérivés des gènes gag, pol, env et nef et les ratios de cellules T CD4+:CD8+ (figure 2). En outre, aucune corrélation statistiquement significative n’a été trouvée entre le nombre de CTL spécifiques du VIH-1 et le nombre de lymphocytes T CD4+ et CD8+ et le nombre de lymphocytes T CD4+ porteurs d’ADN proviral du VIH-1 (données non présentées). Il convient de noter qu’il y avait une tendance à un nombre plus élevé de CTL chez les personnes ayant des ratios de cellules T CD4+:CD8+ plus faibles.

Discussions

L’utilisation généralisée de la HAART dans le traitement de la maladie VIH-1 a conduit à une amélioration spectaculaire des résultats cliniques . Bien que la virémie plasmatique puisse être maintenue en dessous du seuil de détection chez de nombreuses personnes infectées recevant une HAART, la persistance de faibles niveaux de réplication virale en cours dans les cellules T CD4+ a constitué un obstacle majeur à l’éradication du VIH-1 . En effet, la persistance de faibles niveaux de réplication virale est considérée comme le principal facteur de maintien du réservoir du VIH-1, comme en témoigne la fréquence des cellules T CD4+ porteuses de l’ADN proviral du VIH-1 chez les patients dont la virémie plasmatique a été supprimée par la multithérapie jusqu’à un niveau inférieur au seuil de détection des tests standard. De plus, des niveaux soutenus de numération élevée de cellules T CD8+ ont été observés chez une proportion élevée de patients infectés recevant une HAART. A cet égard, il a été suggéré que la réplication virale active est responsable des niveaux élevés de cellules T CD8+ et que les niveaux d’expression du marqueur d’activation CD38 sur ces cellules se sont avérés être un marqueur pronostique de la progression de la maladie en l’absence de thérapie antivirale efficace .

Malgré le manque de données publiées, on a supposé que les rapports inversés des cellules T CD4+:CD8+ dans le sang périphérique des personnes infectées qui sont traitées avec succès par HAART sont dus à de faibles niveaux de réplication virale en cours . Dans la présente étude, nous avons examiné si les ratios inversés de cellules T CD4+:CD8+ chez certaines personnes infectées recevant une HAART pendant des périodes prolongées étaient dus à une suppression incomplète de la réplication du VIH-1, comme le reflète la taille du réservoir d’ADN proviral du VIH-1 dans les cellules T CD4+. La présence persistante de l’ADN proviral du VIH-1 dans le compartiment des cellules T CD4+ chez les patients infectés recevant une HAART a été décrite de manière convaincante ailleurs et on pense qu’elle reflète une inhibition incomplète de la réplication virale résiduelle en cours, malgré la suppression de la virémie plasmatique à des niveaux indétectables . Nous avons démontré une forte corrélation inverse entre la fréquence des cellules T CD4+ infectées contenant de l’ADN proviral du VIH-1 et les ratios de cellules T CD4+ et CD8+, ce qui suggère que les faibles niveaux de réplication virale résiduelle ont pu être en partie responsables des ratios anormaux de cellules T CD4+:CD8+ dans le sang périphérique.

Bien que la fréquence des cellules T CD4+ portant de l’ADN proviral du VIH-1 puisse être directement associée aux ratios de cellules T CD4+:CD8+, d’autres facteurs peuvent affecter cette relation. Des paramètres tels que l’existence de réservoirs de virus inconnus qui entretiennent une réplication virale active en présence d’une multithérapie, des anomalies du système immunitaire de l’hôte, la puissance de régimes thérapeutiques donnés ou d’autres facteurs de confusion peuvent avoir un effet à la fois sur les ratios de cellules T CD4+ : CD8+ et les charges d’ADN proviral dans le compartiment des cellules T CD4+. Nos données suggèrent que la réplication virale continue à des niveaux qui ne sont pas détectables par les tests standard de virémie plasmatique mais qui maintiennent le réservoir de cellules T CD4+ du VIH-1, bien qu’elle soit suffisante pour empêcher la normalisation des ratios de cellules CD4+ : On pourrait faire valoir que les rapports anormaux soutenus des lymphocytes T CD4+:CD8+ chez les personnes infectées qui reçoivent une multithérapie pendant des périodes prolongées pourraient également être attribués à des facteurs immunologiques et virologiques. À cet égard, il a été démontré qu’en l’absence de progression de la maladie et d’une récupération suffisante des cellules T CD4+, l’homéostasie totale des cellules T est maintenue chez les personnes infectées par des niveaux élevés de cellules T CD8+ qui peuvent, à leur tour, interférer avec la régénération des cellules T CD4+. Cependant, nous n’avons pas trouvé de corrélation entre les niveaux de cellules T CD4+ portant l’ADN proviral du VIH-1 et le nombre de cellules T CD8+.

Enfin, des études antérieures ont montré que la génération de cellules T CD4+ dans le thymus est sévèrement entravée par les conséquences directes ou indirectes de la réplication virale active . À cet égard, une diminution des niveaux de production thymique, mesurée par la fréquence des cellules T CD4+ naïves portant des cercles d’excision de réarrangement de récepteurs de cellules T, a été démontrée chez les personnes infectées. Bien qu’il ne soit pas clair si les précurseurs des cellules T CD4+ sont infectés par le VIH-1 dans le thymus, nos données suggèrent fortement que la suppression incomplète de la réplication virale chez les individus infectés recevant une HAART continue à propager l’infection dans le compartiment des cellules T CD4+ dans le sang périphérique, ce qui entraîne le maintien du réservoir de cellules T CD4+ pour le VIH-1.

Remerciements

Nous remercions Paul Parks pour avoir planifié les visites des patients, Susan Moir pour avoir lu ce manuscrit et pour les discussions utiles, et les patients pour leur participation à cette étude.

Figures et tableaux

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