Structure de solution, spécificité des glycanes et de l’activité inhibitrice de la phénol-oxydase des lectines de type C d’Anopheles CTL4 et CTLMA2

Conservation de CTL4/CTLMA2 chez les Anopheles

CTL4 et CTLMA2 sont toutes deux constituées d’un peptide signal, d’une courte séquence N-terminale contenant le motif CXCXC et d’un seul domaine CTL. Un rapport récent a suggéré que la fonction de CTL4 et CTLMA2 ou leurs cofacteurs ont divergé au sein d’Anopheles, et spécifiquement que An. albimanus CTL4 ne contient pas les résidus de cystéine N-terminaux impliqués dans les liaisons disulfure22. Nous avons d’abord réexaminé les orthologues de CTL4 (AGAP005335) et CTLMA2 (AGAP005334), qui ont une orientation proche dos à dos sur le chromosome 2L (Fig. 1a), en utilisant les modèles de gènes actuels (en date de février 2019) dans Vectorbase24. Nous avons trouvé des protéines avec un motif CXCXC N-terminal pour 15/16 orthologues de CTL4, dont An. albimanus AALB014534, et 13/14 orthologues de CTLMA2. Nous avons réalisé des alignements de séquences multiples de CTL4 et CTLMA2 provenant de 10 espèces d’anophèles d’Asie, d’Afrique et du Nouveau Monde (Fig. 1b). Les arbres phylogénétiques non enracinés ont une topologie presque identique, et un arbre phylogénétique combiné a deux branches symétriques, sauf pour la position d’An. dirus par rapport à An. funestus et An. maculatus.

Cela soutient l’hypothèse que CTL4 et CTLMA2 sont conservés au sein du genre Anopheles, les orthologues manquants reflétant l’annotation incomplète de certains génomes. Nous avons examiné la région génomique de trois espèces avec un orthologue de CTL4 rapporté mais pas d’orthologue de CTLMA2 : An. stephensi ASTE002637, An. minimus AMIN007380, et An. melas AMEC014491. Tous possèdent un gène proche ou chevauchant en orientation inverse – ASTE002636, AMIN007379 et AMEC088499, comprenant deux domaines CTL. Pour An. stephensi et An. minimus, le second CTL est précédé d’un motif CXCXC, ce qui suggère qu’il pourrait s’agir d’orthologues de CTLMA2. Chez les moustiques Aedes et Culex, la situation est moins claire. Un orthologue de CTLMA2 comprenant un motif CXCXC N-terminal est annoté chez Ae. albopictus, AALF001196, et possède un gène à deux-exons inversés dos à dos proche AALF001195, comprenant une sérine protéase et un domaine CTL. Le modèle génétique d’octobre 2018 pour Ae. aegypti comprend un orthologue de CTLMA2 avec un motif CXCXC N-terminal, CTLMA14 (AAEL014382), actuellement répertorié comme un orthologue de CTL4). Un orthologue de CTLMA2 est annoté chez C. quinquefasciatus, CPIJ000443, mais ne possède pas le motif CXCXC N-terminal. Ceci suggère que CTLMA2 est apparu dans un ancêtre commun d’Anopheles et d’Aedes alors que CTL4 pourrait être spécifique aux Anopheles.

Caractérisation biochimique

An. gambiae CTL4/CTLMA2 (Ag, Fig. 2a,b), CTL4 et CTLMA2 CRDs (Fig. S1a), et An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Aa, Fig. S1b) ont été exprimés dans des cellules d’insecte en utilisant le système de vecteur d’expression baculovirus (BEVS) et purifiés jusqu’à homogénéité. AgCTL4 mature (25-177) a une masse molaire de 17,3 kDa et un pI de 7,7. AgCTLMA2 mature (18-174) a une masse molaire de 17,9 kDa et un pI de 4,5. L’hétérodimère purifié a une masse moléculaire de 35 kDa sur SDS-PAGE non réductrice (NR) (Fig. 2a) et élue sous forme d’un pic unique sur chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec une masse moléculaire apparente de 40 kDa (Fig. 2b). Les CTL4 et CTLMA2 monomères apparaissent en SDS-PAGE réductrice à 17 kDa et 20 kDa, respectivement. Comme indiqué précédemment, le poids moléculaire apparent accru de CTLMA2 peut refléter sa distribution inhabituelle (acide) d’acides aminés20.

Il a été démontré que An. gambiae CTL4/CTLMA2 est stabilisé par un disulfure intermoléculaire entre les cystéines du motif CXCXC N-terminal ; la mutation de ces trois cystéines en alanine abroge la formation du disulfure inter-chaîne20. Pour affiner l’emplacement du disulfure interchaîne, nous avons construit neuf mutants contenant une seule cystéine dans le motif CXCXC N-terminal de CTL4 et CTLMA2, nous avons co-exprimé les protéines dans des cellules Sf9 et nous avons réalisé un Western Blotting pour détecter CTL4 et CTLMA2. La formation de disulfure intermoléculaire était inefficace mais évidente sur la SDS-PAGE non réductrice dans tous les cas (Fig. 2c).

Cela suggère que la formation de disulfure intermoléculaire N-terminal entre CTL4 et CTLMA2 est promiscuous, plutôt que d’impliquer un résidu de cystéine spécifique de chaque protéine. Si la formation de disulfure intermoléculaire est promiscuous, les hétérodimères CTL4/CTLMA2 pourraient en principe former des oligomères multivalents pontés par un disulfure. Cependant, aucun oligomère lié au disulfure n’est détecté sur NR-SDS-PAGE pour les CTL4/CTLMA2 d’An. gambiae (Fig. 2a). De même, alors que CTL4 et CTLMA2 peuvent former des homodimères à pont disulfure in vitro20, le produit purifié est en grande majorité (>95%) un hétérodimère. Quelques bandes mineures (~10%) sont observées sur NR-SDS-PAGE pour An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b) qui peuvent représenter la formation d’homodimères ou d’oligomères.

Aussi bien An. gambiae CTL4/CTLMA2 que An. albimanus CTL4/CTLMA2 sont polydispersés en solution. L’oligomérisation non-covalente d’ordre supérieur est évidente comme un épaulement du pic principal dans la SEC avec une concentration croissante, et est plus prononcée pour An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1). Nous avons confirmé l’existence d’espèces oligomères par ultracentrifugation analytique à vitesse de sédimentation (AUC) (Fig. 2d). A pH 7,5, une série d’espèces d’intensité décroissante est observée dans la distribution c(s) : s1 = 3,1 s, s2 = 4,4 s, s3 = 5,9 s. L’oligomérisation est indépendante du Ca2+ pour A. gambiae CTL4/CTLMA2 mais augmente substantiellement avec le Ca2+ pour A. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. S1b), et n’est pas corrélée au pH selon la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Fig. 2e).

La liaison au calcium

En tant que CTL, CTL4 et CTLMA2 peuvent se lier au calcium. Cependant, les résidus canoniques de liaison au Ca2+ dans CTL4 sont mutés, ce qui suggère qu’il pourrait s’agir d’un CTLD mais pas d’un CRD de type C. Nous avons donc mesuré l’affinité de liaison au calcium de CTL4 d’An. gambiae, de CTLMA2 et de l’hétérodimère CTL4/CTLMA2 d’An. gambiae et d’An. albimanus par calorimétrie à titrage isotherme (ITC). Dans des conditions équivalentes, la liaison a été observée pour CTLMA2 et CTL4/CTLMA2, mais pas pour CTL4 (Fig. 3a-c). Les constantes de liaison et les paramètres thermodynamiques ont été calculés à partir des résultats de trois expériences indépendantes (tableau 1). La liaison de CTLMA2 Ca2+ est bien ajustée par un modèle à site unique avec KD = 173 ± 27 μM, ΔH = 12 ± 2 kcal/mol. L’affinité de An. gambiae CTL4/CTLMA2 pour le calcium est ~40 × plus élevée que CTLMA2 avec KD = 4.9 ± 0.5 μM, ΔH = -23 ± 4 kcal/mol. An. albimanus CTL4/CTLMA2 (Fig. 3d) a une affinité similaire pour le calcium avec KD = 2,82 μM, ΔH = -12,1 kcal/mol. Cependant, la liaison du calcium à la fois à An. gambiae et à An. albimanus CTL4/CTLMA2 était sous-stoechiométrique (N = 0,36-0,50).

La liaison aux glycans

CTL4 et CTLMA2 appartiennent à la lignée des CTL myéloïdes – dont le récepteur au mannose des macrophages (MMR) et DC-SIGN – qui forment une famille conservée de récepteurs immunitaires chez les métazoaires15,25. Parmi les CTL dont la structure est connue, CTLMA2 présente une identité de séquence de 30 % avec le domaine de reconnaissance des glucides (CRD) du récepteur scavenger de la souris (SCRL, PDB ID 2OX9)26 et de la protéine D du surfactant du porc (SP-D, PDB ID 4DN8)27. CTLMA2 conserve les résidus associés à la liaison du Ca2+ dans la boucle de liaison au glycan, et le motif canonique EPN associé à la sélectivité du D-mannose (Fig. 4a). En revanche, CTL4 est dépourvu de tous les résidus associés à la liaison au Ca2+, ce qui est cohérent avec le fait qu’aucune liaison n’a été observée par ITC. La seule CTL dont la structure est connue et qui présente une grande similitude avec la CTL4 est la protéine de liaison au facteur IX/X (X-bp) provenant du venin du mocassin chinois Deinagkistrodon acutus (1IOD). La X-bp est une CTLD modifiée dans laquelle le domaine de liaison au glycan est remplacé par une longue boucle qui sert de médiateur à la dimérisation pour générer le site de liaison du facteur IX/X. Par conséquent, bien que certains CTL d’insectes ne nécessitent pas de calcium pour la liaison des glycans, il n’est pas clair si CTL4 doit se lier aux glycans du tout.

Afin de définir leur activité de lectine, nous avons analysé CTL4, CTLMA2 et l’hétérodimère CTL4/CTLMA2 sur des tableaux de glycanes qui affichent 367 structures de glycanes uniques28. Ces études ont démontré la liaison à une gamme de glycanes (tableau 2). Les monomères de CTL4 et CTLMA2 se sont liés à seulement quatre et six glycanes, respectivement, alors que l’hétérodimère s’est lié à 18 glycanes différents. Il existe une différence appréciable entre les ligands liés par les monomères individuels et l’hétérodimère ; 3/4 (75%) des glycanes reconnus par CTL4 et 2/6 (33%) des glycanes reconnus par CTLMA2 n’étaient pas reconnus par CTL4/CTLMA2.

Pour confirmer les résultats du glycan array et déterminer les préférences de liaison pour les CTL, une analyse SPR a été réalisée (tableau 3). Dans presque toutes les interactions, le glycan array et le SPR étaient en accord pour la présence d’interactions, le SPR indiquant que le glycan array avait quatre résultats faux négatifs : Le monomère CTLMA2 avec l’antigène H, la chondroïtine sulfate et la chondroïtine-6-sulfate, et le monomère CTL4 avec la chondroïtine-6-sulfate. Cependant, tous les résultats faux négatifs ont montré une liaison sur la matrice avec l’hétérodimère CTL4/CTLMA2.

Les CTL n’ont pas reconnu les glycanes contenant du mannose, à l’exception du mannose-6-phosphate par CTL4/CTLMA2, malgré le motif canonique EPN présent dans CTLMA2. Au contraire, les structures reconnues sont généralement des motifs glycosaminoglycanes (GAG) comprenant des liaisons β1-3/β1-4 entre le glucose (Glc), le galactose (Gal) et leurs hexosamines respectives GlcNac et GalNac. La liaison Galβ1-4Glc était présente dans 12/23 (52%) des glycanes reconnus, dont 6/23 (26%) contenant Galβ1-4GlcNac et 4/23 (17%) contenant le motif kératane Galβ1-4GlcNac β1-3Gal ou GlcNac β1-3Galβ1-4Glc.

Le réseau a également montré une certaine préférence pour les glycanes polymères et sulfatés. Parmi les quatre glycanes reconnus par CTL4, la correspondance la plus forte concernait le globopentaose (Gb5, Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc) ; CTL4 a également lié HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n et le β1-3Glucan (Glcβ1-4Glc)n. Trois des cinq glycanes reconnus par le monomère CTLMA2 étaient sulfatés, et l’hétérodimère CTL4/CTLMA2 reconnaissait le sulfate de chondroïtine et le sulfate de chondroïtine-6, l’acide hyaluronique (GlcAβ1-4GlcNAcβ1-3)8, et l’HA 160 kDa (GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4)n. Ces résultats suggèrent qu’il existe des effets distincts et synergiques de l’hétérodimérisation sur la liaison des glycanes.

La CTLMA2 et l’hétérodimère CTL4/CTLMA2 reconnaissent tous deux plusieurs sucres contenant du fucose, notamment le sialyl-LewisX et le sulfo-LewisA mais pas le sialyl-LewisA. La liaison de la plus haute affinité a été observée pour le sulfo-LewisA avec une liaison au complexe CTLMA2 (106 nM) et CTL4/CTLMA2 (95 nM) à un KD de ~100 nM (Tableau 3). La liaison de plus grande affinité observée pour CTL4 était également à un glycan sulfaté, la sulfo-lactosamine (292 nM).

Analyse structurale

Pour sonder davantage la structure de CTL4 et CTLMA2, nous avons généré des modèles structuraux de CTL4 et CTLMA2 (Fig. 4b) en utilisant MODELLER29 avec une édition manuelle supplémentaire. CTL4 et CTLMA2 ont tous deux une boucle étendue (boucle 1) qui suit la deuxième hélice du CTLD (Fig. 4a) avec une forte densité de résidus chargés complémentaires ; des résidus basiques pour CTL4 et des résidus acides pour CTLMA2. L’électrostatique complémentaire de ces résidus de la boucle 1 et leur proximité avec le motif CXCXC N-terminal suggèrent qu’il s’agit d’une interface protéine/protéine potentielle au sein de l’hétérodimère (Fig. 4b), pour laquelle un modèle hypothétique a été généré avec une seule liaison disulfure dans le motif CXCXC. Cependant, les boucles de liaison glycan/Ca2+ constituent une deuxième interface potentielle, comme observé pour les deux chaînes de D. acutus X-bp. L’autre hypothèse est que les deux domaines CTL sont indépendants l’un de l’autre, avec des lieurs flexibles les reliant via l’hypothèse intermoléculaire.

Pour tester cette hypothèse, nous avons analysé la structure en solution de CTL4/CTLMA2 par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Les expériences ont été menées dans du NaCl 0,5 M, du CHES 20 mM pH 9,0, du CaCl2 0,5 mM et du glycérol 1% pour minimiser les interactions interparticulaires. Dans ces conditions, la protéine a montré une relation linéaire entre l’intensité extrapolée à l’angle zéro et la concentration (I0 vs. c) jusqu’à une concentration de 3,1 mg/ml. La courbe de l’intensité I en fonction de q soustraite au tampon (Fig. 4c) a été soumise à SAXSMoW2 qui donne RG = 23,0 Å (I0 = 0,61) et un poids moléculaire MW = 39 kDa, soit seulement 11 % de plus que le MW attendu de l’hétérodimère de 35 kDa30. Cependant, le tracé de Guinier calculé est basé sur seulement sept points de données ; l’ajustement sur une plage étendue (Fig. 4c, encart) donne RG = 24,5 Å (I0 = 0,64), tandis que l’ajustement de la fonction de distribution par paire P(r) (Fig. 4d) donne un RG = 25,4 Å (I0 = 0,65). L’ajustement de la distribution P(r) par DAMMIF31 avec 20 modèles ab initio de perles avec une divergence structurelle normalisée moyenne NSD = 1,0 ± 0,2. Le corps principal des modèles ab initio a une forme similaire à celle de l’hétérodimère CTL4/CTLMA2 attendu.

Une densité supplémentaire s’étend à partir du corps principal des modèles de billes qui peut refléter soit la séquence N-terminale des deux protéines incluant le motif CXCXC, soit une population mineure de CTL4/CTLMA2 avec un rayon de giration plus élevé. Pour tester cette hypothèse, nous avons effectué une modélisation multi-états du profil SAXS avec le programme MULTIFOXS32. Nous avons généré un modèle complet pour CTL4-6xHis/CTLMA2 avec un coiled-coil N-terminal terminé par un disulfure intermoléculaire entre CTL4 C39 et CTLMA2 C34. MULTIFOXS a généré un ensemble de 10 000 variantes du modèle pour le comparer à la courbe de diffusion expérimentale. Les seuls résidus flexibles étaient les résidus 40-45 et 178-183 (6xHis) de CTL4 et 35-39 de CTLMA2, avec une bobine hélicoïdale N-terminale servant de corps rigide reliant les deux chaînes. Le meilleur modèle à un état s’est adapté aux données avec χ2 = 1,13 et avait RG = 23,7 Å. Le minimum de χ2 = 1,07 a été atteint avec un modèle à 3 états (Fig. 4e), dans lequel 80 % de la diffusion provient de deux modèles compacts avec RG = 22,0 Å et RG = 23,7 Å. Ces données sont cohérentes avec la formation d’un groupe de molécules à deux états. Ces données sont cohérentes avec la formation d’un hétérodimère compact entre CTL4 et CTLMA2.

CTL4/CTLMA2 inhibent l’activation de la phénol oxydase en réponse à E. coli

CTL4 et CTLMA2 fonctionnent comme inhibiteurs de la réponse de mélanisation du moustique à l’infection. Il a été précédemment rapporté que le knockdown de CTL4 n’a pas conduit à une augmentation de l’activité de la phénol oxydase (PO) en réponse à une infection avec un mélange d’E. coli et de S. aureus20. La même étude a toutefois révélé que les moustiques dsCTL4 et dsCTLMA2 étaient spécifiquement sensibles aux bactéries Gram-négatives. Nous avons donc réexaminé l’effet du knockdown de CTL4 et CTLMA2 sur l’activité PO de l’hémolymphe en réponse à une infection par E. coli uniquement (Fig. 5a). 4 heures après l’infection par E. coli, l’activité PO était significativement accrue pour les moustiques dsCTL4 (p = 0,02) et dsCTLMA2 (p = 0,004) par rapport aux contrôles dsLacZ (Fig. 5b). L’efficacité moyenne du knockdown pour CTL4 et CTLMA2 était de 93 ± 3% et 89 ± 3%, respectivement, avec >80% dans une seule expérience.

La mélanisation des ookinetes de Plasmodium lors du silençage de CTL4/CTLMA2 dépend de LRIM117,22, TEP133 et SPCLIP133. Puisque tous ces éléments font partie de la réponse immunitaire de type complément TEP1, nous avons pensé que l’augmentation de l’activité de la PO en l’absence de CTL4 devrait dépendre de TEP1. En conséquence, nous avons comparé l’augmentation de l’activité PO chez les moustiques dsCTL4 avec la co-administration de dsTEP1 à la co-administration de dsLacZ (Fig. 5c). L’efficacité moyenne du knockdown pour TEP1 était de 82 ± 9% et de >80% dans 5/6 expériences (64% dans une expérience). En effet, il n’y avait pas d’augmentation significative de l’activité de la PO chez les moustiques dsCTL4 lorsque TEP1 était également réduit au silence. Ceci confirme que la mélanisation en l’absence de CTL4/CTLMA2 est TEP1-dépendante.

La co-administration de CTL4/CTLMA2 recombinant avec E. coli a inversé de manière significative l’augmentation de l’activité PO chez les moustiques dsCTL4 par rapport à la BSA (p = 0,007, Fig. 5d). Ces résultats démontrent que CTL4/CTLMA2 est directement impliqué comme régulateur négatif de l’activité PO. Toutefois, chez les moustiques dsLacZ, CTL4/CTLMA2 n’a pas supprimé l’activité PO induite par E. coli, contrairement à l’albumine de sérum bovin (BSA). De plus, l’activité PO induite par E. coli chez les moustiques dsCTL4 co-injectés avec des CTL4/CTLMA2 recombinants (dsCTL4 + CTLs) était supérieure à celle des moustiques dsLacZ co-injectés avec de la BSA (dsLacZ + BSA). Par conséquent, l’injection de CTL4/CTLMA2 recombinant ne permet pas de compenser complètement la perte de la protéine endogène.