Az alacsony sűrűségű lipoprotein receptorral kapcsolatos fehérje (LRP), az alacsony sűrűségű lipoprotein receptor géncsalád tagja, sokféle ligandum sejtes felvételét közvetíti. A szekréciós útvonal korai kompartmentjeiben tartózkodó 39 kDa-os receptor-asszociált fehérje (RAP), egy folding chaperon gátolja az összes ligandum receptorhoz való kötődését, és arra szolgálhat, hogy megakadályozza a ligandumok idő előtti kötődését a receptorhoz a sejtfelszínre történő transzport során. A receptor, a RAP és a ligandumok közötti kölcsönhatás hátterében álló molekuláris kölcsönhatások tisztázása érdekében elemeztük és lehatároltuk a plazminogén-aktivátor inhibitor-1 (PAI-1), a szöveti típusú plazminogén-aktivátor (t-PA).PAI-1 komplexek, a RAP és a Fab A8 anti-LRP Fab fragmentum kötőhelyeit. Ebből a célból létrehoztunk egy sor szolubilis rekombináns fragmentumot, amelyek a komplement-típusú ismétlődések második csoportját (C3-C10) és az LRP amino-terminális flankáló epidermális növekedési faktor ismétlődését (E4) fedik le (E4-C10; 787-1165 aminosavak). Valamennyi fragmentumot stabilan transzfektált bébihörcsög vesesejtekkel expresszáltuk és affinitáskromatográfiával tisztítottuk. A fragmensekhez való ligandumkötés részletes vizsgálata felületi plazmon-rezonancia segítségével kimutatta három különböző, Ca2+-függő ligandumkötő hely jelenlétét az LRP II-es klaszterdoménjében (Cl-II). A t-PA.PAI-1 komplexek, valamint a PAI-1 a Cl-II amino-terminális részén található, az E4-C3-C7 ismétléseket átfogó doménhez kötődnek. E hely szomszédságában és részben átfedésben van egy nagy affinitású RAP-kötőhely, amely a C5-C7 ismétlődéseken helyezkedik el. A Fab A8, a receptor pszeudo-ligandja, a Cl-II karboxilterminális végén lévő C8-C10 ismétlődéseken található harmadik Ca2+-függő kötőhelyhez kötődik. Ezután megvizsgáltuk az LRP-hez és a Cl-II-hez való ligandumkötés RAP által közvetített gátlását. A várakozásoknak megfelelően a t-PA.PAI-1 komplex és a Fab A8 LRP-hez való kötődésének erős gátlását figyeltük meg a RAP által (IC50 egyező 0,3 nM), míg a fordított kísérletben a t-PA. PAI-1 komplexek és a Fab A8 RAP-nak az LRP-hez való kötődése csak a versenytársak magas koncentrációinál (>/=1 mikroM) volt kimutatható. Érdekes módon, bár a RAP LRP-hez és Cl-II-hez való kötődésének egyensúlyi disszociációs állandói hasonlóak, a ligandumok Cl-II-hez való kötődését a RAP csak olyan koncentrációban akadályozza meg, amely legalább 2 nagyságrenddel magasabb, mint ami a ligand LRP-hez való kötődésének gátlásához szükséges. Eredményeink olyan modelleknek kedveznek, amelyek a RAP által kiváltott alloszterikus gátlást javasolnak a ligand LRP-hez való kötődésére, amelyhez olyan LRP-részekre lehet szükség, amelyek a receptor Cl-II-jén kívül helyezkednek el.