Az anyagok:
30ml exponenciális SF9 sejtkultúra 5×105 sejt/ml mennyiségben
6 lyuklemez (2 db)
1flakon 4%-os agaróz gél
1flakon SF-900 (1.3X) médium
1 steril palack
0.5ml baculovírus szupernatant
100ml SFM
1. Steril körülmények között adagoljunk 2 ml sejtszuszpenziót lyukanként.
2. Hagyjuk, hogy a sejtek leülepedjenek a lemez aljára, és inkubáljuk lefedve, RT-n 1 órán át.
3. Helyezzük az agaróz gél üvegét a 70oC-os vízfürdőbe. Helyezze az üres palackot és az SF-900 (1,3X) készüléket a 40oC-os fürdőbe.
4. A lemezek 1 órás RT-n történő inkubálását követően vizsgálja meg a monolayereket inverz mikroszkóp alatt, hogy megerősítse a sejtek rögzülését és 50%-os konfluenciáját.
5. Helyezze a lemezeket a 40oC-os fürdőbe. Készítsünk nyolc-log soros hígítást a begyűjtött vírusos felülúszóból úgy, hogy 0,5 ml előző hígításból 4,5 ml SFM médiumban 12 ml-es eldobhatóban egymás után 0,5 ml-t hígítunk. A végén 8 csőnek kell tartalmaznia az eredeti vírusállomány egyenként 10-1-10-8 hígítását.
7. Szekvenciálisan távolítsa el a felülúszót minden egyes üregből, dobja el, és azonnal helyettesítse 1 ml megfelelő vírushígítással minden egyes duplikált üregbe. Inkubáljuk 1 órán át a hőmérsékleten.
8. Amikor az agaróz folyékonnyá válik (20-30 perc), helyezzük át a palackokat a vízfürdőből a sterilháztetőbe.Gyorsan adagoljunk 30 ml SF-900 (1,3X) táptalajt és 10 ml 4%-os agarózzselét az üres palackba, és óvatosan keverjük össze. Használatig tegye vissza a plakkozó fedőanyagot tartalmazó palackot a 40oC-os vízfürdőbe.
9. E második 1 órás inkubációt követően tegye vissza a hígított agarózt tartalmazó palackot és a 6 lyukú lemezeket a motorháztetőbe.
10. Szekvenciálisan (a magas hígítástól az alacsony hígításig) távolítsa el a vírust a lyukakból, és helyezze vissza 2 ml hígított agarózzal. Gyorsan dolgozzon, hogy elkerülje a monoréteg kiszáradását.Egy vákuumszivattyúhoz csatlakoztatott Pasteur-pipetta könnyen eltávolítja az inokulum nyomait.
11.Hagyja a gélt megkeményedni 10-20 percig, mielőtt mozgatná.
12.Inkubálja 27oC-on, párásított inkubátorban 4-10 napig.
13.A rekombináns vírus enyhe kontrasztú, tejszerű/szürke plakkokat hoz létre, amelyek festés vagy más kimutatási módszerek nélkül is láthatók.
14.Monitorozza a plakkokat naponta, amíg a megszámlált plakkok száma két egymást követő napon keresztül nem változik.
15.Az alkalmazott inokulum titerének meghatározásához a számlálás optimális tartománya 3-20 plakk egy 6 lyukú lemez egy lyukában. A titert (pfu/ml) a következő képlettel lehet kiszámítani:
16. Az agaróz természetes vörös színezékkel történő átfedése:
Készítsünk 0,5%-os agaróz oldatot SFM-ben
Adjunk Natural Red oldatot 50 mg/ml végkoncentrációig (3,33 mg/ml törzsoldat 1:66,6 arányban hígítva).
Helyenként (6 lyukú lemezen) 1 ml festékoldatot helyezzünk minden egyes lyukba.
Helyenként 1 ml-t a festékoldatból.