Trasporto di cistina e cistinosina
La cistina si accumula nei lisosomi dei leucociti cistinotici14 e dei fibroblasti.44 La clorochina e altri inibitori della degradazione lisosomiale delle proteine attenuano il riaccumulo di cistina nelle cellule cistinotiche impoverite, indicando che la degradazione intracellulare delle proteine è la fonte della cistina in eccesso.45 Il contenuto di cistina delle cellule normali e cistinotiche può essere aumentato anche caricando con cistina dimetil estere46 o disolfuro misto cisteina-glutatione44 ; in particolare, però, l’uscita della cistina dai lisosomi è marcatamente compromessa nelle cellule cistinotiche caricate con cistina.44,46 L’efflusso di cistina da cellule derivate da portatori eterozigoti del gene della cistinosi nefropatica non è significativamente compromesso rispetto alle cellule wild-type.44 Tuttavia, la misurazione del controtrasporto cistina-cistina nei granuli lisosomiali dimostra chiaramente un’assenza nei pazienti omozigoti, con valori per i portatori eterozigoti che sono circa la metà di quelli delle normali cellule di controllo47 ; il difetto del trasporto lisosomiale della cistina è quindi il difetto causale della cistinosi.
La diagnosi biochimica sia dei pazienti48 che dei portatori eterozigoti49 è stata fondamentale per la mappatura fine del gene della cistinosi sul cromosoma 17p13. Un passo avanti fondamentale è stato il rilevamento di delezioni genomiche per un marcatore microsatellite collegato, seguito dall’identificazione del gene CTNS all’interno dell’intervallo minimo di delezione.50 Il gene CTNS comprende 12 esoni, che codificano una proteina di 367 aminoacidi chiamata cistinosina. La cistinosina consiste di sette domini transmembrana, un terminale N di 128 aminoacidi che contiene sette siti di glicosilazione e un terminale C citosolico di 10 aminoacidi. Tutti i pazienti con i vari sottotipi di cistinosi sembrano avere una mutazione nel gene CTNS (cioè, non vi è alcuna prova finora di eterogeneità genetica). La mutazione più comune è una delezione di 57 kb che sposta la regione 5′ a monte dell’esone 1051,52; oltre il 70% dei pazienti con cistinosi nefropatica di origine nord europea sono omozigoti per questa mutazione.52-54 Bendavid e colleghi hanno sviluppato sonde di ibridazione in situ a fluorescenza per questa grande delezione, la prima del suo genere per un disordine di accumulo lisosomiale.55 Mutazioni separate di effetto fondatore putativo sono state identificate nel Canada francese56 (W138X, di origine irlandese) e nella provincia francese della Bretagna57 (una mutazione splice-site alla fine dell’esone 8). Una mutazione missense ricorrente (G339R) è stata identificata in due particolari popolazioni etniche: due famiglie non imparentate di origine amish-mennonita e cinque famiglie non imparentate di origine ebraico-marocchina.58-61 Sono state identificate anche altre 50 mutazioni di CTNS, compresi almeno tre pazienti con mutazioni nella regione del promotore del gene.62 I pazienti con cistinosi giovanile o oculare sono omozigoti per una mutazione “più lieve”, tipicamente una mutazione puntiforme senza interruzione dell’open reading frame; in alternativa, questi pazienti sono eterozigoti composti per una mutazione lieve e una mutazione più grave.17,59
La cistinosina è ampiamente espressa, con una trascrizione particolarmente abbondante nel pancreas, nel muscolo e nel rene.50 L’immunoistochimica con anticorpi anti-cistinosina63 e la trasfezione di cellule con DNA complementare legato all’epitopo (cDNA)64,65 rivela che la proteina è espressa nei lisosomi. Come previsto, l’espressione della cistinosina è particolarmente robusta nel tubulo prossimale renale.63 La localizzazione della cistinosina alla membrana lisosomiale si basa sia su un motivo di smistamento lisosomiale GYDQL basato sulla tirosina situato sulla coda C-terminale che su un pentapeptide YFPQA all’interno del quinto anello intertrasmembrana. Il motivo YFPQA è in qualche modo unico in quanto è un raro esempio di segnale di smistamento lisosomiale situato al di fuori della coda citoplasmatica.64 Sembra mostrare una certa capacità di salvare lo smistamento della cistinosina da solo, dato che il mutante cistinosina con un motivo GYDQL assente ma un motivo YFPQA intatto si localizza ancora parzialmente nei lisosomi.65 Una minoranza di mutazioni della cistinosi influenzano il targeting lisosomiale della cistinosina, a causa della rottura primaria del motivo GYDQL o di effetti non ancora caratterizzati sulla struttura secondaria.66
La caratterizzazione funzionale della cistinosina ha sfruttato il reindirizzamento della proteina alla membrana plasmatica in un mutante, cistinosina-.GYDQL, che manca del motivo GYDQL C-terminale.67 La cistinosina-.GYDQL funziona quindi come un trasportatore di cistina guidato da H+ nella membrana plasmatica delle cellule trasfettate. È altamente specifico per la L-cistina; altri aminoacidi, in particolare la cisteina monosolfuro, non sono substrati. La cistinosina è saturabile e segue la cinetica di Michaelis-Menton, con un Km per la cistina di ∼280 μM.67 Il trasporto verso l’interno è notevolmente stimolato da un pH extracellulare acido-esterno (Fig. 14-6); il collasso di questo gradiente transmembrana H+ con l’aggiunta di nigericina abolisce il trasporto, coerentemente con il cotrasporto H+-cistina da parte della cistinosina. Il trasporto lisosomiale di cistina è a sua volta dipendente dalla presenza di adenosina trifosfato (ATP), che alimenta la H+-ATPasi lisosomiale e guida l’efflusso di cistina (Fig. 14-7).46,68,69
Il costrutto cistinosina-.GYDQL è stato utilizzato per la caratterizzazione funzionale di mutazioni missense associate alla malattia nella cistinosina. Per la maggior parte, il trasporto e i fenotipi clinici sono correlati, con l’abolizione del trasporto da parte delle mutazioni associate alla cistinosi nefropatica e la funzione residua mediata dai costrutti che esprimono mutazioni associate ai sottotipi giovanili e oculari della malattia.66 Tuttavia, alcune mutazioni associate alla cistinosi giovanile aboliscono il trasporto nel contesto della cistinosina-.GYDQL, suggerendo che queste mutazioni hanno effetti minori sulla cistinosina a lunghezza intera espressa nelle membrane lisosomiali; una possibilità è che la cistinosina interagisca con proteine lisosomiali che stabilizzano queste particolari forme mutanti.66 Si verifica anche il contrario, per cui alcune mutazioni della cistinosi nefropatica hanno un effetto minimo sul trasporto mediato dalla cistinosina-.GYDQL.66
La delezione mirata della cistinosina nei topi porta all’accumulo di cistina in più organi, compreso il rene.70 Il deposito focale di cristalli di cistina può essere rilevato in diversi tessuti, anche all’interno delle cellule del tubulo prossimale. Tuttavia, questi topi non mostrano una tubulopatia prossimale, il che suggerisce che l’accumulo di cristalli di cistina da solo non è causativo della malattia.70 Tuttavia, le anomalie oculari nei topi con deficit di cistinosina sono molto simili ai pazienti con cistinosi. Questi animali sviluppano così depositi di cristalli di cistina nella cornea e chiazze depigmentate nella retina, indicative di una retinopatia.70