Materiali:
30ml di coltura esponenziale di cellule SF9 a 5×105 cellule/ml
6 piastre a pozzetti (2 ciascuna)
1 bottiglia di gel di agarosio al 4%
1 bottiglia di SF-900 (1.3X) medium
1bottiglia sterile
0.5ml surnatante di baculovirus
100ml SFM
1. In condizioni sterili dispensare 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto.
2. Consentire alle cellule di stabilirsi sul fondo della piastra e incubare, coperto, a RT per 1h.
3. Mettere la bottiglia di gel di agarosio nel bagno d’acqua 70oC. Posizionare il emptybottle e il SF-900 (1.3X) nel bagno 40oC.
4. Following1h incubazione delle piastre a RT, osservare monostrati sotto il microscopio invertito per confermare l’attaccamento delle cellule e il 50% confluenza.
5. Producean otto-log diluizione seriale del surnatante virale raccolto da sequentialdiluting 0,5 ml della diluizione precedente in 4,5 ml di mezzo SFM in 12-mldisposable. Si dovrebbe concludere con 8 tubi contenenti ciascuno di un 10-1 a 10-8 diluizione del brodo virus originale.
7. Sequentiallyremove il surnatante da ogni pozzo, scartare, e sostituire immediatamente con 1 ml della diluizione rispettivo virus a ciascun pozzo duplicato. Incubare per 1h atRT.
8. Movebottles da bagni d’acqua alla cappa sterile quando agarosio ha liquido (20 a 30 min).Quickly dispensare 30 ml del SF-900 (1.3X) medio e 10 ml del 4% agarosegel alla bottiglia vuota e mescolare delicatamente. Restituire il flacone di plaquing overlayto il bagno d’acqua 40oC fino all’uso.
9. A seguito di questa seconda incubazione 1h, restituire la bottiglia di agarosio diluito e il 6-pozzetti alla cappa.
10.Sequenzialmente (da alta a bassa diluizione) rimuovere il virus dai pozzi e sostituire con 2 ml di agarosio diluito. Una pipetta Pasteur collegata a una pompa a vuoto rimuove facilmente le tracce di inoculo.
11.Lasciare indurire il gel per 10-20 minuti prima di muoversi.
12.Incubare a 27oC in un’incubatrice umidificata per 4-10 giorni.
13.Il Recombinantvirus produce placche lattiginose/grigie di leggero contrasto visibili senza colorazione o altri metodi di rilevamento.
14.Monitorare le placche ogni giorno fino a quando il numero di placche contate non cambia per due giorni consecutivi.
15.Determinare il titolo dell’inoculo impiegato, un intervallo ottimale per contare è da 3 a 20 placche per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Il titolo (pfu/ml) può essere calcolato con la seguente formula:
16. Sovrapposizione di agarosio con colorante Natural Red:
Preparare 0,5% agarosio soluzione in SFM
Aggiungere Natural Red soluzione ad una concentrazione finale di 50mg/ml (diluire 3,33mg/ml stock 1:66,6).
Overlay 1ml della soluzione colorante per ogni pozzetto (su un 6 pozzetti).