Bacteriële co-cultuur met cell signaling translator en growth controller modules voor autonoom gereguleerde kweeksamenstelling

AI-1 signaal gecontroleerde celgroeisnelheid

We testten eerst E. coli celgroeisnelheidscontrole via transcriptionele regulatie van ptsH, een gen betrokken bij suikertransport. HPr (gecodeerd door ptsH) wordt algemeen erkend als een van een reeks eiwitten (b.v. E1, HPr, EII) die achtereenvolgens een fosforylgroep van fosfoenolpyruvaat (PEP) naar glucose (of een ander PTS-koolhydraat) overbrengt34. HPr is zeer goed geconserveerd37. Onlangs ontdekten we dat HPr interageert met het AI-2 kinase LsrK, waardoor de AI-2 opname beïnvloed wordt35. We hebben de AI-2 modulerende functionaliteit later benut bij de constructie van de AI-2 sensing cel. Hier toonden we aan dat ptsH mutant stammen langzamer groeien dan wild type stammen in minimale media die glucose bevatten (Supplementary Fig. 1a). Wanneer ptsH werd geplaatst onder een IPTG induceerbare promotor in een ptsH mutant, kon de groeisnelheid worden gecontroleerd op basis van IPTG toevoeging (Supplementary Fig. 1b). Belangrijk is dat we hebben aangetoond dat het induceren van expressie van ptsH resulteert in een toename van de celgroei. Even belangrijk, dit gedrag is ongeacht of de media bevat glucose als de belangrijkste koolstofbron (Supplementair Fig. 1c).

Op basis van dit proof of concept, we volgende gemanipuleerd QS-signaal gecontroleerde groeisnelheid. Om de controlestam te construeren, werd ptsH onder controle van de AI-1 lasI QS promotor op het plasmide pAHL-HPr (Fig. 2a) in een ptsH mutant stam PH04 geplaatst. Elders op het plasmide werden zowel dsRedExpress2, voor celvisualisatie, als LasR, vereist voor activering van de lasI promoter, tot expressie gebracht onder een constitutieve T5 promoter. Toevoeging van AI-1 aan de controlestam verhoogde de celgroei tot 1,8 maal de uitgangsgroei op een dosisafhankelijke wijze (Fig. 2b). De gemeten specifieke groeisnelheid (tussen 1 en 4 uur na toevoeging van AI-1) diende als basis voor een Monod-type model van de groeisnelheid gebaseerd op het AI-1 niveau (Fig. 2c).

AI-1 moduleert samenstelling in controllercel co-culturen

De AI-1 gereguleerde controllercellen werden vervolgens geco-cultuurd met andere stammen om na te gaan of toevoeging van AI-1 de samenstelling van de co-cultuur wijzigde. Groeicontroleercellen die een rood fluorescerend eiwit tot expressie brengen (PH04 pAHL-ptsH) werden gecultuurd met PH04 pCT6 of TOP10 pT5G7. PH04 pCT6 heeft een vergelijkbare baseline groeisnelheid als PH04 pAHL-ptsH, terwijl TOP10 pT5G aanzienlijk sneller groeit. De culturen werden bij ongeveer gelijke celdichtheid geïnoculeerd en aangevuld met verschillende AI-1-concentraties. Na 8 uur werden monsters genomen voor analyse met fluorescentiemicroscopie en gekwantificeerd met ImageJ. Zoals verwacht nam de kweeksamenstelling van de controleercellen, wanneer ze met PH04 werden gekweekt, toe met toenemende AI-1-concentratie (Fig. 3a). Een soortgelijke trend werd waargenomen wanneer cellen werden gekweekt met TOP10, ondanks de snellere groeisnelheid van TOP10 (Fig. 3b). Dat wil zeggen, in co-culturen zonder AI-1, de fractie van de controller cellen in de TOP10 co-culturen eigenlijk aanzienlijk gedaald van de initiële ~ 0,5 tot ~ 0,09 tijdens de daaropvolgende 8 uur. Toevoeging van AI-1 tegengegaan dat groeisnelheid verschil en resulteerde in een hoger niveau van controller cellen tijdens dezelfde 8 uur periode. Deze resultaten tonen aan dat, ongeacht andere stammen in de cultuur en hun respectieve groeisnelheden, AI-1 (dat geen E. coli QS-signaalmolecule is) de groeisnelheid van de gemanipuleerde regelaarstam moduleert en dat de verandering voldoende snel optreedt om een waarneembare verandering in de samenstelling van de cultuur mogelijk te maken, met name zelfs onder batchomstandigheden van relatief korte duur (in tegenstelling tot fed-batch, herhaalde batch- of continuculturen).

Volgende, de AI-1 gereguleerde controller stam werd gecultiveerd met cellen die AI-1 produceren wanneer geïnduceerd. PH04 pSox-LasI en PH04 pAHL-HPr werden samen gecultiveerd. Plasmide pSox-LasI bevat lasI, dat AI-1 synthetiseert, onder de pyocyanine-induceerbare soxS-promotor7. In dit experiment ontvangt de regelaarstam een signaal van een translaterstam die op zijn beurt AI-1 produceert als reactie op pyocyanine. Op die manier wordt aangetoond dat het co-cultuurbesturingssysteem reageert op een bepaald moleculair signaal. In dit geval werd elke cultuur met ongeveer gelijke startdichtheden geïnoculeerd en werden de co-culturen al dan niet blootgesteld aan pyocyanine. Blootgestelde culturen vertoonden een verhoogde productie van AI-1 en een overeenkomstige verhoogde samenstelling van PH04 pAHL-HPr binnen 5 uur (Fig. 3c). Deze resultaten tonen aan dat AI-1 geproduceerd door een andere stam de groeisnelheid van de controlestam kan moduleren, en dat dit kan gebeuren op een tijdschaal die nodig is om veranderingen in een batchproces teweeg te brengen. Bovendien toont dit de potentiële haalbaarheid aan van een door de gebruiker gereguleerde co-cultuur op basis van een gebruikersspecifieke toepassing van een molecule of inducer, in dit geval pyocyanine. Vervolgens hebben we de translatorstam ontwikkeld om een autonoom gereguleerde co-cultuur te creëren op basis van het alomtegenwoordige AI-2-signaalmolecuul.

Ontwerp van AI-2-voelende translatorcellen

Om cellijnen te construeren die AI-2 voelen en AI-1 produceren, hebben we stammen ontwikkeld om de expressie van LasI te activeren, dat AI-1 synthetiseert, wanneer de AI-2 lsr-promotor wordt geactiveerd. Wij gebruikten een systeem met twee plasmiden om de expressie van de zwakke lsr-promotor te versterken25 (Fig. 4a). AI-2 wordt gefosforyleerd door LsrK en gefosforyleerde AI-2 verlicht de repressie van de promoter door LsrR, waardoor de transcriptie van de lsr-transportergenen toeneemt en de AI-2-opname versnelt. Tegelijkertijd resulteert AI-2-gemedieerde activering van de lsr-promotor in transcriptie van T7 RNA-polymerase uit plasmide pCT6 en daaropvolgende transcriptie van lasI uit plasmide pET-LasI.

Het systeem werd eerst geconstrueerd in de E. coli-gastheerstam CT104, die een luxS-mutant is (d.w.z. niet in staat om AI-2 te produceren). CT104 mist ook lsrFG, dat verantwoordelijk is voor de afbraak van het gefosforyleerde AI-2 signaal, waardoor de cel gevoeliger wordt voor AI-238. Wij verifieerden dat deze cellijn, CT104 pCT6 pET-LasI, AI-1 produceerde wanneer gekweekt in geconditioneerde media (CM) van AI-2 producerende BL21 (Supplementaire Fig. 2). BL21 werden gekweekt tot variërende celdichtheden, CM werd verzameld, en CT104 cellen werden gekweekt in de verzamelde CM. Belangrijk is dat de door de CT104 cellen geproduceerde AI-1 gecorreleerd was met de dichtheid van de AI-2 producerende BL21 cellen (Supplementary Fig. 2a). We testten ook of translatorcellen toegevoegd aan consortia met variërende fracties van AI-2 producerende cellen het AI-1 signaal konden produceren op basis van de consortiaamenstelling. CT104-cellen werden toegevoegd aan culturen met variërende verhoudingen van BL21 (luxS+) tot BL21 ΔluxS. Na 6 uur was het niveau van het AI-1-signaal in de extracellulaire media indicatief voor de kweeksamenstelling, die op haar beurt voornamelijk gebaseerd is op de initiële fractie van luxS+ cellen25 (aanvullende fig. 2b).

De bovenstaande experimenten toonden aan dat een cellijn kon worden geconstrueerd om AI-1 te produceren in reactie op AI-2 uit AI-2-producerende cellen. Deze experimenten werden uitgevoerd in LB-media en niet in media met glucose. De aanwezigheid van glucose remt AI-2 opname en lsr promotor activiteit39 en het gebruik van de CT104 cellen zou kunnen worden beperkt tot media zonder glucose (zie aanvullende Fig. 3 voor schema van AI-2 QS pathway). Op basis van de kennis van de AI-2 QS systeem, hebben we geprobeerd om een stam die in staat was van AI-2 opname en lsr promotor activering in glucose bevattende media engineeren. Op deze manier zouden onze resultaten meer algemeen kunnen worden toegepast. Eerder toonden wij aan dat HPr (gecodeerd door ptsH) interageert met LsrK, waardoor de kinase-activiteit van LsrK wordt geremd, en dat ptsH-mutanten aantoonbaar AI-2 opnemen, zelfs in media die glucose bevatten35. Daarom stelden wij de hypothese voorop dat het gebruik van PH04 (ΔptsH ΔluxS) als gastheerstam de productie van AI-1 op basis van AI-2 in glucosehoudende media mogelijk zou maken. Wij testten de translatorcellen met beide gastheerstammen in LB en M9 glucosemedia met en zonder AI-2. Het geproduceerde AI-1-niveau was afhankelijk van de toevoeging van AI-2, maar ook van de gastheerstam en het medium (Fig. 4b). Beide stammen produceerden AI-1 wanneer de cellen aan LB-media met AI-2 werden toegevoegd. Zoals verwacht, resulteerde het gebruik van de CT104-gastheerstam in M9-media in een kleine of onbeduidende vouwverandering in AI-1-activiteit bij vergelijking van culturen met en zonder AI-2. Belangrijk is echter dat de PH04 translatorcellen een door AI-2 geactiveerde productie van AI-1 vertoonden in M9 + glucosemedia. Op deze wijze kon het gemanipuleerde systeem worden gebruikt in glucose-bevattende media.

Karakterisering van PH04 translatorcellen

PH04 translatorcellen nemen het AI-2-signaalmolecuul op, transduceren het signaal door activering van expressie van LasI en synthetiseren en scheiden AI-1 uit. De gewenste AI-1 output is dan een functie van de AI-2 input. Wij hebben de door AI-2 gesignaleerde productie van AI-1 in de PH04 translatorstam gekarakteriseerd in de tijd en voor een reeks biologisch relevante AI-2 concentraties. De snelheid van de AI-1-productie door PH04 translatorcellen bleek dosisafhankelijk te zijn van AI-2 (Fig. 5a). We merken op dat onder deze en vergelijkbare omstandigheden AI-2 meestal binnen 4 uur wordt verbruikt (Fig. 5b). Toevoeging van AI-2 of AI-2-gebaseerde productie van AI-1 in deze batchculturen resulteerde niet in een waarneembare afname van de celgroei (fig. 5c). Vervolgens karakteriseerden wij voor elke geteste AI-2-concentratie de AI-1-productie per cel in de tijd door een logistische functie door de AI-1-gegevens te plotten, de afgeleide van deze vergelijking in de tijd te bepalen en de afgeleide door de celdichtheid in de tijd te delen (aanvullende tabel 1), wat een tijdafhankelijke specifieke productiesnelheid oplevert. De resulterende grafieken (fig. 5d) tonen het geschatte AI-1-productietempo per cel als functie van de toegevoegde AI-2 en de tijd na de toevoeging van AI-2. Zoals later zal worden aangetoond, stemt dit overeen met een onderliggende observatie die we hebben waargenomen dat het traject van genexpressie in reactie op een initiële cue vrij robuust is21,38,40.

Naar aanleiding van de test werd het effect van AI-1 geproduceerd door de PH04-vertalercellen op de groeisnelheid van de AI-1-responsieve regelaarcellen getest. Dat wil zeggen, groei responsieve cellen werden toegevoegd aan CM met AI-1 van vertaler cellen die waren blootgesteld aan verschillende niveaus van AI-2 en gekweekt voor ~ 3 uur (Supplementary Fig. 4a). Beyond wat werd getoond in Fig. 5 waar AI-1 wordt gegenereerd uit directe blootstelling aan AI-2, dit experiment toont aan dat de cel vertaling van AI-2 in AI-1 kan worden gedaan met de nodige expressie en celcultuur dynamiek, zodat de groeisnelheid van de tweede populatie (Supplementary Fig. 4b) te beïnvloeden. We merken ook op, dat de dynamische groeisnelheid van de controller cellen bleek af te nemen in de tijd in de daaropvolgende 3 uur. Deze waarneming werd gemaakt meer dramatisch in latere co-cultuur experimenten.

Autonome regulering van co-cultuur samenstelling

Wij voegden vervolgens de vertaler cellen (aangeduid als Populatie A) en de AI-1 responsieve controller cellen (Populatie B) aan oplossingen met een bereik van initiële AI-2 concentraties. In co-culturen van vertaler cellen en controller cellen, de vertaler cellen autonoom regelen consortia samenstelling op basis van initiële AI-2 niveau. In supplementaire Fig. 5, de co-culturen met verhoogde initiële AI-2 niveaus resulteerde in een toename van AI-1 (Supplementaire Fig. 5b) en een overeenkomstige toename van de relatieve overvloed van Populatie B (Supplementaire Fig. 5a). Deze resultaten toonden het concept aan van signaal-gemedieerde autonome controle van consortia populatie. Belangrijk is dat de schattingen van de groeisnelheid voor Populatie A en Populatie B overeenkwamen met de verwachte groeisnelheidswaarden gemeten tijdens monocultuur-experimenten (Supplementaire Fig. 5c).

Nadat we hadden aangetoond dat vertalerscellen de samenstelling van consortia konden reguleren op basis van blootstelling aan AI-2, ontwikkelden we een wiskundig model om de dynamiek van het systeem te karakteriseren. Op deze manier kan men het gedrag van de co-cultuur voorspellen gegeven specifieke initiële condities, groeisnelheid ontwerpen, enz. om parameters te bepalen die nodig zijn om een gewenste output te bereiken. Dit conceptueel eenvoudige wiskundige model werd gecreëerd om het gedrag van de co-cultuur te voorspellen aan de hand van gegevens van de individuele stammen. Het model bestaat uit vier gewone differentiaalvergelijkingen, één voor elke populatiedichtheid, substraatconcentratie en AI-1 concentratie (supplementaire tabellen 2 en 3). Monod-groeikinetiek met een constante opbrengstcoëfficiënt werd gebruikt om celgroei en substraatconcentratie te modelleren, met extra functies voor de productie en/of effecten van de QS-moleculen. De door populatie A geproduceerde AI-1 is gebaseerd op zowel de mate van blootstelling aan AI-2 als de tijd (fAI1). In het vorige werk38 vonden we dat tijdsafhankelijke trajecten van celgedrag een gevolg waren van initiële blootstelling aan auto-inducer, zodat tijdsafhankelijke functies van AI-1 productie hier plausibel zouden zijn. De groeisnelheid van Populatie B werd geformuleerd op basis van het heersende niveau van AI-1 (fHPr). De maximale specifieke groeisnelheden werden gemeten aan de hand van experimentele gegevens, de opbrengsten werden geschat op basis van de experimenteel waargenomen stationaire-fase-dichtheid en bekende initiële substraatconcentraties, en de K1- en K2-waarden werden gekozen op basis van literatuurwaarden voor glucose. De MATLAB (versie R2016a) ode45 solver werd gebruikt om het systeem van ODE’s op te lossen. Het model kan worden gebruikt om aan te tonen hoe een co-cultuurpopulatie naar verwachting met de tijd zal veranderen, gegeven deze eenvoudige fenomenologische snelheidsvergelijkingen en best-fit constanten. Zoals gezegd, vormt dit de basis om te bepalen of zelfs maar kan worden voorspeld dat een co-cultuur evolueert gedurende de beperkte tijd die beschikbaar is in een batchcultuur. Belangrijk is dat onze resultaten van monoculturen worden gebruikt om experimentele resultaten van co-culturen te simuleren.

Dat wil zeggen, we evalueerden vervolgens autonoom geprogrammeerde co-cultuur controle via modelvoorspellingen. Co-culturen van Populaties A en B werden bij elkaar geplaatst voor een reeks van initiële celpopulaties en werden vervolgens toegevoegd aan media met voorgeschreven niveaus van AI-2 om een populatietraject in gang te zetten. In ons systeem wordt de initiële samenstelling geselecteerd op basis van de verhouding van de in de co-cultuur geleverde cellen en wordt de kweeksamenstelling vervolgens autonoom aangepast in de tijd op basis van het AI-2 niveau in de media. We hebben de resultaten vergeleken met ons model. In fig. 6 worden de samenstelling van de co-cultuur en het AI-1-niveau na 5 uur getoond voor diverse omstandigheden, waaronder variërende initiële A:B-verhoudingen en AI-2-niveau. In deze tests hebben wij één initiële populatie celdichtheid gebruikt. Belangrijk is dat ons model de experimentele resultaten van zowel het AI-1 niveau als de samenstelling van de co-cultuur goed voorspelde. We merken ook op dat het model kan worden gebruikt om initiële condities te selecteren die een gewenste output geven. Om bijvoorbeeld een populatie B te bereiken met een relatieve celdichtheid van 55% na 5 uur, kan de co-cultuur gestart worden met een initiële A:B verhouding van 60:40 en een AI-2 concentratie van 40 µM. Andere scenario’s werden getest en gevalideerd, zoals afgebeeld. Deze resultaten tonen duidelijk aan dat de initiële toestand van de celsamenstelling (bv. verhouding A:B) en de blootstelling aan verschillende niveaus van AI-2 beide het traject van de co-cultuurpopulatie beïnvloeden. Even belangrijk is echter dat de orthogonale signaalmolecule, AI-1, zich gedroeg zoals gemodelleerd. We verwachten dat, bij uitbreiding, het opnemen van deze en andere translatorsignalen het mogelijk zal maken om meer gevarieerde of meer gecompliceerde consortia te ontwerpen en/of te controleren.

Dat wil zeggen dat we het co-cultuurcontrolesysteem hebben getest door blootstelling aan een AI-2 concentratie, 80 µM, die hoger was dan de AI-2 concentraties die werden gebruikt om de translatorcellen te karakteriseren, en waarvoor we geen model hadden. Wij gebruikten de resultaten van de co-cultuur (Fig. 6) om het gedrag van vertaler cellen in een monocultuur bij deze AI-2 concentratie in te schatten. Vervolgens voerden we monocultuurexperimenten uit door 80 µM AI-2 toe te voegen aan translatorcellen en toonden we aan dat we in staat waren het monocultuurgedrag te voorspellen met behulp van de co-cultuurgegevens en het model. Aanvullende Fig. 6a toont de snelheid van AI-1 productie voorspeld uit de co-cultuur gegevens en het model (lijn) en de werkelijke snelheid van AI-1 productie tijdens de monocultuur experiment (datapunten). Aanvullende Fig. 6b toont de voorspelde AI-1 niveaus in de monocultuur in de tijd vergeleken met de werkelijk gemeten AI-1 niveaus. Het voorspelde AI-1-niveau werd bepaald met behulp van het model, waarbij de geschatte AI-1-productiesnelheid en de aanvankelijke celdichtheid van de monocultuur werden ingevoerd.

Ten slotte hebben wij ons co-cultuursysteem gedurende een langere periode getest met behulp van herhaalde batchvoeding met meervoudige toevoegingen van AI-2 (Fig. 7). Hier was het onze bedoeling het populatietraject uit te breiden tot boven het traject dat werd verkregen door de initiële samenstelling en de blootstelling aan een vast AI-2 niveau in een eenvoudige batchcultuur te variëren. Op deze manier testen we de robuustheid van het regelschema. Bijvoorbeeld, in Fig. 6, voor culturen met aanvankelijk ~40% populatie B, vonden we dat we alleen niveaus van populatie B konden bereiken die 60% benaderden en alleen door blootstelling aan hoge niveaus (>80 uM) van AI-2. Door het testen van een herhaalde batch-systeem, dachten we dat we de B-populatie te rijden tot meer dan 80% door simpelweg resuspending en uitbreiding van het systeem in de tijd. We voegden onze co-cultuur aan media met verschillende niveaus van AI-2 en om de 3 uur we resuspendeerde de cellen in verse media met extra AI-2. Onmiddellijk vóór elke resuspensie werden monsters genomen voor analyse van de AI-1-concentratie en de samenstelling van de celcultuur (Fig. 7a, b). De celdichtheid en AI-2 activiteit werden eveneens gemeten (Supplementary Fig. 7). Wij stelden vast dat het systeem in deze complexere experimentele opzet over het algemeen werkte zoals ontworpen. Wij stelden vast dat door blootstelling aan kleinere hoeveelheden AI-2 (20 en 40 μM), wij bijna 80% populatie B konden bereiken. Tijdens deze test stelden wij echter vast dat onze experimentele resultaten afweken van de resultaten die door ons mathematisch model werden voorspeld. Wij hebben de geproduceerde AI-1 en de groeisnelheid van de culturen gedurende elk segment van 3 uur nader bekeken om een inzicht te krijgen in de kweekdynamiek op basis van de waargenomen afwijking van het eenvoudige model. Zo was bijvoorbeeld de AI-1-productie tijdens de tweede en derde drie-uurscyclus hoger dan door het model werd voorspeld. Achteraf gezien was dit logisch omdat de cellen na de eerste batchcyclus reeds LasI hadden geproduceerd (dat AI-1 synthetiseert), en de bijkomende AI-2 waarschijnlijk verdere productie van LasI op gang bracht (wij hadden geen degradatiemarkering op LasI aangebracht, zodat het behoud ervan had moeten worden voorzien). Vervolgens hebben wij het model zo aangepast dat de AI-1 productiesnelheid aan het begin van elke volgende resuspensie in nieuwe media dezelfde was als aan het einde van de vorige cyclus (Fig. 7c, ononderbroken lijnen). De opname van deze nieuwe functies voor de AI-1-productie in het model resulteerde in waarden voor AI-1 die goed pasten bij de experimentele AI-1-gegevens (Fig. 7a, model in ononderbroken lijnen). Evenzo hebben wij de groeisnelheid van de controlecellen geschat (zie aanvullende noot 1) en vastgesteld dat de groeisnelheid in combinatie met de AI-1 concentraties niet paste in onze eerdere fAI1 functie (Fig. 7d). Wij merken op dat wij voor de berekening van de groeisnelheid van de regelaarcellen ervan uitgingen dat de groeisnelheid van de vertalerscellen constant bleef, hoewel deze als gevolg van herhaalde toevoegingen van AI-2 enigszins kan zijn afgenomen. Hoewel de groeisnelheid van de controleurcellen aanvankelijk leek toe te nemen als functie van AI-1, daalde de totale groeisnelheid bij latere resuspensies in verse media. Wij hadden eerder een dynamische daling van de groeisnelheid vastgesteld bij overexpressie van HPr en LasI (supplementaire Figs. 4 en 5). Hier vermoeden wij dat een metabolische belasting van de cellen door herhaalde blootstelling aan hoge niveaus van AI-1 of verminderde substraat- of nutriëntenniveaus oorzaken kunnen zijn geweest voor de verminderde groei tijdens de latere cycli. Belangrijk is dat we door ons model zo aan te passen dat het effect van AI-1 op de groeisnelheid afnam met de tijd (zie aanvullende noot 2), in staat waren om onze experimentele gegevens te passen (Fig. 7b, aangepast model in ononderbroken lijnen) zonder het model complexer te maken.

In het kort, onze co-cultuur systeem reageerde zoals ontworpen of het werd geplaatst in media zonder AI-2 of met een hoog niveau van AI-2. Bovendien lieten onze resultaten controleerbare populatiedichtheden zien die 40 tot 80% van de controleercellen omvatten. Ook, vergelijking met ons oorspronkelijke model gaf inzicht in hoe het systeem zich gedroeg in deze meer complexe experimentele set-up; de vertaler cellen leek te produceren hogere niveaus van AI-1 in de tijd, terwijl de controller cellen leek te hebben verminderde AI-1 gereguleerde veranderingen in de groeisnelheid in de tijd.

Finitief, kan het model een basis bieden om te verkennen in silico hoe de strategieën die hier gebruikt voor autonoom gereguleerde culturen (gekenmerkt door signaal-gereguleerde groeisnelheid en native cel-cel signalering) kan worden uitgebreid tot andere systemen, met inbegrip van de gebruiker-gereguleerde of programmeerbare systemen die dynamisch kunnen worden gecontroleerd. Zo onderscheiden chemostatculturen zich van het huidige autonome systeem doordat hun output wordt gestuurd door door de gebruiker gespecificeerde inputs, zoals de verdunningssnelheid. Als eerste stap hebben we simulaties uitgevoerd van chemostat-gekweekte co-culturen door toevoeging van de standaard flow-termen aan het batch-model (Supplementary Fig. 8, Supplementary Tables 4 en 5). We ontdekten dat in sommige gevallen de verdunningssnelheid een steady-state kweeksamenstelling bepaalt, die vervolgens kan worden “afgestemd” binnen een door de verdunningssnelheid afgebakend bereik. De “afstemming” kan worden bereikt door externe modulatie van de cel-celsignalering, bijvoorbeeld door exogene toevoeging van signaalmoleculen. Deze gevallen illustreren hoe de wisselwerking tussen ons autonoom systeem en andere door de gebruiker gecontroleerde systemen kan leiden tot complexere populatietrajecten. Onze simulatieresultaten hier dienen als een conceptueel kader voor het controleren van de samenstelling van consortia in meer complexe, door de gebruiker gestuurde systemen. Verdere bespreking van de chemostat simulaties zijn in Supplementary Note 3.